Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen
Summary
Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.
Abstract
De ontdekking van celtypespecifieke markers kan inzicht verschaffen in de cellulaire functie en de oorsprong van cellulaire heterogeniteit. Met een recente push voor het verbeterde begrip van neuronale diversiteit is het belangrijk genen te identificeren waarvan de expressie verschillende subpopulaties van cellen definieert. Het retina dient als een uitstekend model voor de studie van de diversiteit van het centrale zenuwstelsel, omdat het bestaat uit meerdere belangrijke celtypes. De studie van elke belangrijke celklasse heeft genetische markers opgedaan die de identificatie van deze populaties vergemakkelijken. Echter, er zijn meerdere subtypes van cellen binnen elk van deze belangrijke retinale celklassen, en weinig van deze subtypes hebben genetische markers bekend, hoewel veel door morfologie of functie gekenmerkt zijn. Kennis van genetische markers voor individuele retinale subtypen zou de studie en het in kaart brengen van hersendoelstellingen in verband met specifieke visuele functies mogelijk maken en kan ook inzicht geven in de genenetwerken dieHandhaven van cellulaire diversiteit. Huidige lijnen die gebruikt worden om de genetische markers van subtypen te identificeren bezitten nadelen, zoals de classificatie van celtypen die volgend op sequentiebepaling. Dit geeft een uitdaging voor data-analyse en vereist strikte validatiemethoden om ervoor te zorgen dat clusters cellen van dezelfde functie bevatten. Wij stellen een techniek voor om de morfologie en functionaliteit van een cel te identificeren voorafgaand aan isolatie en sequencing, waardoor de subtypespecifieke markers eenvoudiger kunnen worden geïdentificeerd. Deze techniek kan uitgebreid worden naar niet-neuronale cel typen, evenals zeldzame populaties van cellen met kleine variaties. Dit protocol levert uitstekende data, zoals veel bibliotheken hebben gelezen diepte groter dan 20 miljoen leest voor enkele cellen. Deze methode overwint veel van de hindernissen die door single-cell RNA-Seq worden gepresenteerd en kunnen geschikt zijn voor onderzoekers die op een eenvoudige en zeer efficiënte manier mobiele types typen.
Introduction
Neuronale diversiteit wordt waargenomen in het centrale zenuwstelsel, in het bijzonder in het vertebrate retina, een zeer gespecialiseerd weefsel dat bestaat uit 1 glial- en 6 neuronale celtypen die voortvloeien uit een populatie van retinale voorlopercellen 1 , 2 , 3 . Veel subtypes van cellen kunnen functioneel, morfologisch en genetisch worden ingedeeld. Het doel van dit protocol is om de genetische variabiliteit van celtypen te binden aan hun identificeerbare functionele en / of morfologische eigenschappen. Er zijn een aantal genen geïdentificeerd voor de indeling van cellen, maar veel subtypes blijven ongekarakteriseerd, aangezien zij een kleine fractie van de totale populatie vertegenwoordigen. De identificatie van genen binnen deze specifieke subtypes zal een groter begrip van de neuronale diversiteit in het netvlies mogelijk maken en kan ook de diversificatie van neurale cellen elders schuiven. FuDaarnaast kunnen single-cell studies de ontbinding van nieuwe celtypes toestaan, die kunnen worden over het hoofd gezien door hun lage representatie onder de totale populatie 4 , 5 , 6 , 7 .
Een van de voordelen van single-cell transcriptomics is dat unieke markers of combinaties van markers die een bepaald cellulaire subtype definiëren, ontdekt kunnen worden. Deze kunnen dan gebruikt worden om genetische toegang te krijgen tot dat celtype voor verschillende manipulaties. Bijvoorbeeld, we gebruiken dit protocol om de celtype-specifieke genen van een subset van retinale ganglioncellen die de fotopigment melanopsin uitdrukken, te karakteriseren. Het gebruik van een fluorescerende marker in melanopsine-expressie-retinale ganglioncellen maakt het mogelijk om deze cellen te bestuderen, aangezien ze samen worden geclusterd door hun expressie van een bekend gen. Interessant genoeg zijn er vijf bekende subtypen van deze cel popuLatie in het muisnetje 8 . Dus, om RNA van cellen van elk type te isoleren, hebben we gevestigde morfologische classificaties binnen het transgene model gebruikt om elk subtype voorafgaand aan celisolatie te identificeren. Deze techniek zorgt voor de karakterisering van cellen alsook voor hun isolatie rechtstreeks van het retina, zonder dat er een weefseldissociatie nodig is, wat een stressrespons binnen cellen kan veroorzaken en besmetting door afgescheiden dendrieten 9 .
In de afgelopen jaren is een groot aantal nieuwe technieken aan het licht gekomen, aangezien de RNA-Seq-methode verder ontwikkelt. Deze hulpmiddelen maken het mogelijk om een maximale celverwerving te verkrijgen en een grotere kosten-efficiëntie, terwijl u de vraag 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 nadert. Echter, terwijlDeze technieken zijn uitstekende stepping stones, er zijn nog steeds een aantal hindernissen die dit protocol kan adresseren. Ten eerste isoleren veel van de huidige procedures cellen uit gedissocieerd weefsel en proberen om hoofdcomponentanalyse of hiërarchische clustering posthoc te gebruiken om de celclassificatie te bepalen. Vertrouwen op deze hulpmiddelen om subtypes te classificeren, kan geen betrouwbare resultaten opleveren en kan een dwingen om nieuwe manieren te vinden om deze gegevens te valideren voor de correlatie van een genetische marker naar een functioneel celtype. De vereiste voor dissociatie in andere protocollen kan soms weefselschade veroorzaken en kunnen neuronale processen scheiden, waardoor een mogelijk verlies van mRNA kan ontstaan. Bovendien kunnen in de gedissocieerde celpreparaten de stressresponsen beginnen de transcriptomen van deze cellen 14 te beïnvloeden. Dit protocol overwint deze uitdagingen door het functionele celtype voorafgaand aan isolatie te bepalen en het handhaaft het beterGezondheid van de cellen door het retinale weefsel intact te houden.
Een techniek werd in 2014 geïntroduceerd en bestond uit de in vivo analyse van het transcriptoom van levende cellen 15 . Hoewel deze techniek het onderzoek van het transcriptoom met minimale mechanische verstoring van het weefsel mogelijk maakt, ontbreekt het de mogelijkheid om specifieke celsoorten in het weefsel te classificeren alvorens hun transcriptomen te onderzoeken zonder gebruik te maken van een zeer specifieke reportermuis. Ons protocol heeft geen specifieke reporter nodig, omdat we celvulling en elektrofysiologie gebruiken om cellen te karakteriseren voor hun isolatie. Een andere beperking van dit vorige protocol is dat het een specifieke golflengte nodig heeft om het foto-activeerbare element op te wekken, terwijl ons protocol het mogelijk maakt om een fluorescerende reporter en fluorescerende kleurstof te gebruiken die gemakkelijk verkrijgbaar zijn of per laboratorium afzonderlijk kunnen worden gekozen. Nog steeds hebben andere laboratoria getrouwd met de twee methoden van electrOphysiologie en transcriptomics voor de studie van cellulaire diversiteit. Het gebruik van patch-klemopnamen om de functie van een cel voorafgaand aan zijn isolatie te karakteriseren is uitgevoerd op gedissocieerde neuronen 16 en in sommige gevallen is het voorafgegaan door het gebruik van microarray analyse 17 voor deze studies. Dezelfde complicaties worden ondervonden door deze benaderingen, aangezien ze weefseldissociatie of het gebruik van microarray technologie nodig hebben, die afhankelijk is van de hybridisatie van monsters naar beschikbare probes. Een van de meest recente ontwikkelingen is de ontwikkeling van Patch-Seq, een techniek die het gebruik van patch-clamp-opnamen en RNA-Seq-technologie combineert om cellen van hele hersenschijfjes 18 te begrijpen. Hoewel deze techniek haar overeenkomsten heeft met het hier gepresenteerde protocol, is het opnieuw belangrijk om op te merken dat onze aanpak het in staat stelt om het weefsel intact te houden voor de gezondheid van de cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de optimizatIon van deze alliantie, die hoge kwaliteit, single-cell bibliotheken voor het gebruik van RNA-Seq genereert om een hoge leesdiepte en mapping dekking te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons protocol toont door middel van een snelle en makkelijk te gebruiken gids een methode om enkele cellen van geïdentificeerde morfologische klassen voor hoogwaardige sequencing op te stellen, met weinig letsel aan het monster. In het huidige manuscript worden intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen morfologisch gekenmerkt, geïsoleerd en bereid voor RNA-Seq. Cellulaire spanning kan optreden tijdens retinale behandeling; Om deze reden vervangen we elk stuk weefsel na maximaal 4 uur gebruik. We kunnen de toest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Jennifer Bair en Einat Snir, evenals de Universiteit van Iowa Institute for Human Genetics, erkennen voor hun hulp bij het voorbereiden en verwerken van monsters.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
