RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano
Summary
Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.
Abstract
El descubrimiento de los marcadores específicos de tipo celular puede proporcionar una visión de la función celular y los orígenes de la heterogeneidad celular. Con un impulso reciente para la comprensión mejorada de la diversidad neuronal, es importante identificar genes cuya expresión define varias subpoblaciones de células. La retina sirve como un excelente modelo para el estudio de la diversidad del sistema nervioso central, ya que está compuesto de múltiples tipos de células principales. El estudio de cada clase principal de células ha producido marcadores genéticos que facilitan la identificación de estas poblaciones. Sin embargo, existen múltiples subtipos de células dentro de cada una de estas clases principales de células retinianas, y pocos de estos subtipos tienen marcadores genéticos conocidos, aunque muchos se han caracterizado por morfología o función. Un conocimiento de los marcadores genéticos para los subtipos individuales de la retina permitiría el estudio y la asignación de los objetivos cerebrales relacionados con funciones visuales específicas y también puede aportar una visión de las redes de genes queMantener la diversidad celular. Las vías actuales utilizadas para identificar los marcadores genéticos de subtipos poseen inconvenientes, como la clasificación de los tipos de células después de la secuenciación. Esto representa un desafío para el análisis de datos y requiere métodos de validación rigurosos para asegurar que los clústeres contengan células de la misma función. Proponemos una técnica para la identificación de la morfología y la funcionalidad de una célula antes de aislamiento y secuenciación, lo que permitirá la identificación más fácil de subtipo específico de marcadores. Esta técnica puede extenderse a tipos de células no neuronales, así como a poblaciones raras de células con variaciones menores. Este protocolo proporciona datos de excelente calidad, ya que muchas de las bibliotecas han proporcionado profundidades de lectura superiores a 20 millones de lecturas para celdas individuales. Esta metodología supera muchos de los obstáculos presentados por Single-cell RNA-Seq y puede ser adecuado para los investigadores con el objetivo de perfil de tipos de células de una manera directa y altamente eficiente.
Introduction
La diversidad neuronal se observa en todo el sistema nervioso central, particularmente en la retina vertebrada, un tejido altamente especializado que consta de 1 tipo glial y 6 tipos de células neuronales que surgen de una población de células progenitoras de la retina 1 , 2 , 3 . Muchos subtipos de células se pueden clasificar funcionalmente, morfológicamente y genéticamente. El objetivo de este protocolo es vincular la variabilidad genética de los tipos de células con sus características funcionales y / o morfológicas identificables. Se han identificado varios genes para la clasificación de las células, pero muchos subtipos continúan no caracterizados, ya que representan una pequeña fracción de la población total. La identificación de genes dentro de estos subtipos específicos permitirá una mayor comprensión de la diversidad neuronal dentro de la retina y también puede arrojar luz sobre la diversificación de las células neuronales en otros lugares. FuAdemás, los estudios monocelulares permiten descubrir nuevos tipos de células, que pueden haber sido pasadas por alto debido a su baja representación entre la población total 4 , 5 , 6 , 7 .
Uno de los beneficios de la transcriptómica monocelular es que se pueden descubrir marcadores únicos o combinaciones de marcadores que definen un subtipo celular particular. Estos pueden ser utilizados para obtener acceso genético a ese tipo de célula para diferentes manipulaciones. Por ejemplo, estamos utilizando este protocolo para caracterizar los genes específicos del tipo celular de un subconjunto de células ganglionares de la retina que expresan el fotopigmento melanopsina. El uso de un marcador fluorescente en la melanopsina que expresan las células ganglionares de la retina permite el estudio de estas células, ya que se agrupan juntos debido a su expresión de un gen conocido. Curiosamente, hay cinco subtipos conocidos de esta célula popuEn la retina del ratón 8 . Por lo tanto, con el fin de aislar el ARN de las células de cada tipo, hemos utilizado clasificaciones morfológicas establecidas dentro del modelo transgénico para identificar cada subtipo antes del aislamiento celular. Esta técnica permite la caracterización de las células, así como para su aislamiento directamente de la retina, sin necesidad de disociación de los tejidos, lo que puede causar una respuesta al estrés dentro de las células y la contaminación debida a las dendritas cortadas [ 9] .
Una multitud de nuevas técnicas han salido a la luz en los últimos años como el método de RNA-Seq continúa desarrollándose. Estas herramientas permiten maximizar la adquisición de células y una mayor eficiencia de costos al abordar la cuestión en cuestión 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Sin embargo, mientrasEstas técnicas han sido excelentes pasos, hay una serie de obstáculos todavía se encuentran que este protocolo es capaz de abordar. En primer lugar, muchos de los procedimientos actuales aislar las células de tejido disociado y tratar de utilizar ya sea el análisis de componentes principales o agrupación jerárquica post-hoc para determinar la clasificación de células. Basarse en estas herramientas para clasificar subtipos no puede producir resultados confiables y puede forzar a uno a encontrar nuevas formas de validar estos datos para la correlación de un marcador genético con un tipo de célula funcional. El requisito de disociación en otros protocolos puede a veces resultar en daño tisular y puede provocar que los procesos neuronales sean cortados, dando como resultado una pérdida potencial de mRNA. Además, en las preparaciones de células disociadas, las respuestas de estrés pueden comenzar a afectar a los transcriptomas de estas células [ 14] . Este protocolo supera estos desafíos mediante la determinación del tipo de célula funcional antes del aislamiento, y mantiene mejor la hLa salud de las células, manteniendo el tejido retiniano intacto.
Una técnica se introdujo en 2014 y consistió en el análisis in vivo del transcriptoma de células vivas [ 15] . Aunque esta técnica permite el examen del transcriptoma con una interrupción mecánica mínima del tejido, carece de la capacidad de clasificar tipos de células específicas dentro del tejido antes de examinar sus transcriptomas sin usar un ratón reportero muy específico. Nuestro protocolo no requiere un reportero específico, ya que utilizamos el relleno celular y la electrofisiología para caracterizar las células antes de su aislamiento. Otra limitación de este protocolo anterior es que requiere una longitud de onda específica para excitar el elemento fotoactivable, mientras que nuestro protocolo permite el uso de un reportero fluorescente y un colorante fluorescente, que están fácilmente disponibles o pueden ser seleccionados individualmente por cada laboratorio. Sin embargo, otros laboratorios se han casado con los dos métodos de electrFisiología y transcriptómica para el estudio de la diversidad celular. El uso de grabaciones de patch-clamp para caracterizar la función de una célula antes de su aislamiento se ha realizado en neuronas disociadas 16 y, en algunos casos, ha precedido al uso de análisis de microarrays 17 para estos estudios. Las mismas complicaciones son encontradas por estos enfoques, ya que requieren la disociación de tejidos o el uso de la tecnología de microarrays, que se basa en la hibridación de las muestras a las sondas disponibles. Uno de los avances más recientes ha sido el desarrollo de Patch-Seq, una técnica que combina el uso de grabaciones de patch-clamp y la tecnología RNA-Seq para entender las células de las rodajas del cerebro entero [ 18] . Si bien esta técnica tiene sus similitudes con el protocolo presentado aquí, es importante recordar que nuestro enfoque permite que el tejido permanezca intacto para la salud de las células. Aquí, presentamos un protocolo para el optimizatDe esta alianza, que genera bibliotecas de una sola célula de alta calidad para el uso de RNA-Seq para obtener una alta profundidad de lectura y cobertura de mapeo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro protocolo demuestra, a través de una guía rápida y fácil de usar, un método para preparar células individuales de las clases morfológicas identificadas para la secuenciación de alta calidad, con poco daño a la muestra. En el presente manuscrito, las células ganglionares retinianas intrinsecamente fotosensibles se caracterizan morfológicamente, se aíslan y se preparan para RNA-Seq. Las tensiones celulares pueden ocurrir durante el manejo de la retina; Por esta razón, sustituimos cada pieza de tejido …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Jennifer Bair y Einat Snir, así como al Instituto de Genética Humana de la Universidad de Iowa, por su ayuda en la preparación y manejo de muestras.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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