Her presenterer vi en kombinatorisk tilnærming for klassifisering av nevrale celletyper før isolasjon og for den etterfølgende karakterisering av enkeltcelletransskriptomer. Denne protokollen optimaliserer utarbeidelsen av prøver for vellykket RNA-sekvensering (RNA-Seq) og beskriver en metodikk som er spesielt utviklet for å forbedre forståelsen av cellulært mangfold.
Oppdagelsen av celletypespesifikke markører kan gi innsikt i cellefunksjon og opprinnelsen til cellulær heterogenitet. Med en nylig press for forbedret forståelse av neuronal mangfold, er det viktig å identifisere gener hvis uttrykk definerer ulike subpopulasjoner av celler. Retina fungerer som en utmerket modell for studiet av sentralnervesystemdiversitet, da det består av flere store celletyper. Studien av hver hovedklasse av celler har gitt genetiske markører som letter identifiseringen av disse populasjonene. Imidlertid finnes det flere undertyper av celler innenfor hver av disse store retinale celleklasser, og få av disse subtypene har kjent genetiske markører, selv om mange har blitt preget av morfologi eller funksjon. Kunnskap om genetiske markører for individuelle retinale subtyper vil tillate studier og kartlegging av hjernemål rettet mot bestemte visuelle funksjoner og kan også gi innsikt i gennettene somOpprettholde mobilt mangfold. Nåværende veier som brukes til å identifisere de genetiske markørene til subtypene, har ulemper, for eksempel klassifisering av celletyper som følger sekvensering. Dette gir en utfordring for dataanalyse og krever strenge valideringsmetoder for å sikre at klynger inneholder celler med samme funksjon. Vi foreslår en teknikk for å identifisere morfologi og funksjonalitet av en celle før isolering og sekvensering, noe som vil tillate enklere identifisering av subtypespesifikke markører. Denne teknikken kan utvides til ikke-neuronale celletyper, så vel som sjeldne populasjoner av celler med mindre variasjoner. Denne protokollen gir data av utmerket kvalitet, ettersom mange av bibliotekene har gitt lese dybder større enn 20 millioner, leser for enkeltceller. Denne metoden overstyrer mange av hindrene presentert av single-cell RNA-Seq og kan være egnet for forskere som har som mål å profilere celletyper på en enkel og svært effektiv måte.
Neuronal mangfold er observert gjennom sentralnervesystemet, spesielt i ryggradshinnen, et høyt spesialisert vev som består av 1 glial og 6 nevrale celletyper som oppstår fra en populasjon av retinale stamceller 1 , 2 , 3 . Mange subtyper av celler kan klassifiseres funksjonelt, morfologisk og genetisk. Målet med denne protokollen er å knytte den genetiske variabiliteten til celletyper til deres identifiserbare funksjonelle og / eller morfologiske egenskaper. En rekke gener er identifisert for klassifisering av celler, men mange subtyper fortsetter å gå ukarakterisert, da de representerer en liten del av den totale befolkningen. Identifikasjonen av gener innenfor disse spesifikke subtypene vil muliggjøre en større forståelse av neuronal mangfold i retina og kan også kaste lys over diversifiseringen av nevrale celler andre steder. FuVidere kan enkeltcellede studier muliggjøre avdekking av nye celletyper, som kanskje har blitt oversett på grunn av deres lave representasjon blant den samlede befolkningen 4 , 5 , 6 , 7 .
En av fordelene ved enkeltcelletranscriptomikk er at unike markører eller kombinasjoner av markører som definerer en bestemt cellulær subtype, kan oppdages. Disse kan da brukes til å få genetisk tilgang til den celletypen for forskjellige manipulasjoner. For eksempel bruker vi denne protokollen til å karakterisere celletypespesifikke gener av en delmengde av retinale ganglionceller som uttrykker fotopigmentet melanopsin. Bruken av en fluorescerende markør i melanopsin-uttrykkende retinale ganglionceller gjør det mulig å studere disse cellene, da de blir klynget sammen på grunn av deres uttrykk for et kjent gen. Interessant er det fem kjente undertyper av denne cellen popuLation i muslinen 8 . For å isolere RNA fra celler av hver type har vi således brukt etablerte morfologiske klassifikasjoner innenfor den transgene modellen for å identifisere hver subtype før cellisolasjon. Denne teknikken tillater karakterisering av celler så vel som isolasjon direkte fra netthinnen, uten behov for vevsdissociasjon, noe som kan forårsake stressrespons i celler og forurensning på grunn av avskårne dendriter 9 .
En rekke nye teknikker har kommet til lys de siste årene, ettersom RNA-Seq-metoden fortsetter å utvikle seg. Disse verktøyene tillater maksimert celleoppkjøp og større kostnadseffektivitet mens du nærmer deg spørsmålet ved hånden 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Imidlertid, mensDisse teknikkene har vært gode stepping stones, det er en rekke hindringer fortsatt oppdaget at denne protokollen er i stand til å adressere. Først isolerer mange av de nåværende prosedyrene celler fra dissociert vev og forsøker å bruke enten hovedkomponentanalyse eller hierarkisk clustering post-hoc for å bestemme celleklassifisering. Å stole på disse verktøyene for å klassifisere undertyper, kan ikke produsere pålitelige resultater og kan tvinge en til å finne nye måter å validere disse dataene for korrelasjonen av en genetisk markør til en funksjonell celletype. Kravet på dissosiasjon i andre protokoller kan noen ganger føre til vevskader og kan føre til at neuroneprosesser blir kuttet, noe som resulterer i et potensielt tap av mRNA. Videre kan i spredte cellepreparater begynne å påvirke transkriptomene av disse cellene 14 . Denne protokollen overvinter disse utfordringene ved å bestemme funksjonell celletype før isolasjon, og det opprettholder bedre hEalth av cellene ved å holde retinal vev intakt.
En teknikk ble introdusert i 2014 og besto av in vivo analyse av transkriptomet av levende celler 15 . Mens denne teknikken tillater undersøkelse av transkriptomet med minimal mekanisk forstyrrelse av vevet, mangler det evnen til å klassifisere spesifikke celletyper i vevet før de undersøker transkriptomerene uten å bruke en meget spesifikk reportermus. Vår protokoll krever ikke en bestemt reporter, da vi bruker cellefylling og elektrofysiologi til å karakterisere celler før isolasjonen. En annen begrensning av denne tidligere protokollen er at den krever en bestemt bølgelengde for å spenne det fotoaktiverbare elementet, mens protokollen vår tillater bruk av en fluorescerende reporter og fluorescerende fargestoff, som er lett tilgjengelig eller kan velges av hver enkelt laboratorie individuelt. Likevel har andre laboratorier giftet seg med to metoder for elektrOphysiologi og transkriptomikk for studier av cellulær mangfold. Bruken av patch-clamp-opptak for å karakterisere funksjonen til en celle før isolasjonen, har blitt utført på dissocierte nevroner 16, og i noen tilfeller har den gått foran bruken av mikroarrayanalyse 17 for disse studiene. De samme komplikasjonene oppdages av disse tilnærmingene, da de krever vevsdissociasjon eller bruk av mikroarray-teknologi, som er avhengig av hybridisering av prøver til tilgjengelige prober. En av de siste fremskrittene har vært utviklingen av Patch-Seq, en teknikk som kombinerer bruken av patch-clamp-opptak og RNA-Seq-teknologi for å forstå celler fra helhjerneskiver 18 . Selv om denne teknikken har likheter med protokollen som presenteres her, er det igjen viktig å merke seg at vår tilnærming tillater at vevet forblir intakt for cellens helse. Her presenterer vi en protokoll for optimaliseringenIon av denne alliansen, som genererer høykvalitets, single-cell biblioteker for bruk av RNA-Seq for å oppnå en høy lese dybde og kartlegging dekning.
Vår protokoll demonstrerer, gjennom en rask og brukervennlig guide, en metode for å forberede enkeltceller av identifiserte morfologiske klasser for kvalitetssekvensering, med liten skade på prøven. I det nåværende manuskriptet er iboende lysfølsomme retinale ganglionceller morfologisk karakterisert, isolert og fremstilt for RNA-Seq. Cellulære påkjenninger kan oppstå under retinalhåndtering; Av denne grunn erstatter vi hvert stykke vev etter ikke mer enn 4 timer bruk. Vi kan vurdere tilstanden til cellene ved…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne anerkjenne Jennifer Bair og Einat Snir, samt Universitetet i Iowa Institute for Human Genetics, for hjelp til å forberede og håndtere prøver.
Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
PCR Primer II A | PCR Primer | ||
SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
TD Buffer | Buffer 2 | ||
ATM | Tagmentation Mix | ||
NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
NPM | PCR Master Mix | ||
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
N501 | White 1 | ||
N502 | White 2 | ||
N701 | Orange 1 | ||
N702 | Orange 2 | ||
HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |