Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano
Summary
Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.
Abstract
A descoberta de marcadores específicos de tipo de célula pode fornecer insight sobre a função celular e as origens da heterogeneidade celular. Com um impulso recente para a compreensão melhorada da diversidade neuronal, é importante identificar genes cuja expressão define várias subpopulações de células. A retina serve como um excelente modelo para o estudo da diversidade do sistema nervoso central, pois é composta de vários tipos de células principais. O estudo de cada uma das principais classes de células produziu marcadores genéticos que facilitam a identificação dessas populações. No entanto, existem vários subtipos de células dentro de cada uma destas classes de células principais da retina, e poucos destes subtipos têm marcadores genéticos conhecidos, embora muitos tenham sido caracterizados por morfologia ou função. Um conhecimento dos marcadores genéticos para os subtipos retinais individuais permitiria o estudo e mapeamento de alvos cerebrais relacionados com funções visuais específicas e também pode dar uma visão das redes genéticas queManter a diversidade celular. As vias actuais utilizadas para identificar os marcadores genéticos de subtipos possuem inconvenientes, tais como a classificação de tipos de células após sequenciação. Isso representa um desafio para a análise de dados e requer métodos de validação rigorosos para garantir que os clusters contenham células da mesma função. Propomos uma técnica para identificar a morfologia e a funcionalidade de uma célula antes do isolamento e seqüenciamento, o que permitirá a identificação mais fácil de marcadores subtipo-específicos. Esta técnica pode ser alargada a tipos de células não neuronais, bem como a raras populações de células com pequenas variações. Este protocolo produz dados de excelente qualidade, uma vez que muitas bibliotecas forneceram profundidades de leitura superiores a 20 milhões de leituras para células individuais. Esta metodologia supera muitos dos obstáculos apresentados por Single-cell RNA-Seq e pode ser adequado para pesquisadores com o objetivo de perfil tipos de células de uma maneira simples e altamente eficiente.
Introduction
A diversidade neuronal é observada em todo o sistema nervoso central, particularmente na retina dos vertebrados, um tecido altamente especializado consistindo em 1 tipo glial e 6 tipos de células neuronais que surgem de uma população de células progenitoras da retina 1 , 2 , 3 . Muitos subtipos de células podem ser classificados funcionalmente, morfologicamente e geneticamente. O objectivo deste protocolo é ligar a variabilidade genética dos tipos de células às suas características funcionais e / ou morfológicas identificáveis. Vários genes foram identificados para a classificação de células, mas muitos subtipos continuam a não ser caracterizados, uma vez que representam uma pequena fracção da população total. A identificação de genes dentro destes subtipos específicos permitirá uma maior compreensão da diversidade neuronal dentro da retina e também pode lançar luz sobre a diversificação de células neurais em outro lugar. FuAlém disso, os estudos monocelulares permitem a descoberta de novos tipos de células, que podem ter sido negligenciadas devido à sua baixa representação entre a população global 4 , 5 , 6 , 7 .
Um dos benefícios da transcriptômica monocelular é que marcadores únicos ou combinações de marcadores que definem um subtipo celular particular podem ser descobertos. Estes podem então ser utilizados para obter acesso genético a esse tipo de célula para diferentes manipulações. Por exemplo, estamos usando este protocolo para caracterizar os genes específicos do tipo celular de um subconjunto de células ganglionares retinianas que expressam a fotopigmentação melanopsina. O uso de um marcador fluorescente em células de gânglio retiniano que expressam melanopsina permite o estudo destas células, uma vez que são agrupadas em conjunto devido à sua expressão de um gene conhecido. Curiosamente, existem cinco subtipos conhecidos desta célula popuLação na retina do rato 8 . Assim, para isolar ARN de células de cada tipo, utilizamos classificações morfológicas estabelecidas dentro do modelo transgénico para identificar cada subtipo antes do isolamento celular. Esta técnica permite a caracterização das células bem como o seu isolamento directamente a partir da retina, sem a necessidade de dissociação do tecido, o que pode causar uma resposta ao stress dentro das células e contaminação devido a dendrites cortados 9 .
Uma multidão de novas técnicas vieram à luz nos últimos anos como o método RNA-Seq continua a desenvolver. Estas ferramentas permitem maximizar a aquisição de células e maior eficiência de custos ao abordar a questão 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . No entanto, enquantoEstas técnicas têm sido excelentes pedras, há uma série de obstáculos ainda encontrou que este protocolo é capaz de endereço. Primeiro, muitos dos procedimentos atuais isolam as células de tecido dissociado e tentam usar a análise de componentes principais ou agrupamento hierárquico pós-hoc para determinar a classificação celular. Confiar nestas ferramentas para classificar subtipos pode não produzir resultados fiáveis e pode forçar um a encontrar novas formas de validar estes dados para a correlação de um marcador genético para um tipo de célula funcional. O requisito para dissociação em outros protocolos pode por vezes resultar em danos ao tecido e pode causar processos neuronais a ser cortado, resultando em uma perda potencial de mRNA. Al� disso, em prepara�es de c�ulas dissociadas, as respostas de tens� podem começar a afectar os transcriptomas destas c�ulas 14 . Este protocolo supera estes desafios, determinando o tipo de célula funcional antes do isolamento, e mantém melhor a hA conservação do tecido retiniano intacto.
Uma técnica foi introduzida em 2014 e consistiu na análise in vivo do transcriptoma de células vivas 15 . Embora esta técnica permita o exame do transcriptoma com uma interrupção mecânica mínima no tecido, carece da capacidade de classificar tipos de células específicos dentro do tecido antes de examinar os seus transcriptomas sem utilizar um rato repórter muito específico. Nosso protocolo não requer um repórter específico, pois utilizamos preenchimento celular e eletrofisiologia para caracterizar as células antes do seu isolamento. Outra limitação deste protocolo anterior é que requer um comprimento de onda específico para excitar o elemento fotoactivável, enquanto que o nosso protocolo permite a utilização de um repórter fluorescente e corante fluorescente, que estão prontamente disponíveis ou podem ser escolhidos individualmente por cada laboratório. Ainda, outros laboratórios casaram os dois métodos de elétrFisiologia e transcriptômica para o estudo da diversidade celular. O uso de gravações de patch-clamp para caracterizar a função de uma célula antes do seu isolamento foi realizado em neurónios dissociados 16 e, em alguns casos, precedeu o uso de análise de microarranjos 17 para estes estudos. As mesmas complicações são encontradas por essas abordagens, pois requerem dissociação de tecidos ou o uso de tecnologia de microarray, que depende da hibridização de amostras para sondas disponíveis. Um dos avanços mais recentes tem sido o desenvolvimento de Patch-Seq, uma técnica que combina o uso de gravações patch-clamp e tecnologia RNA-Seq para entender as células de todo o cérebro fatias [ 18] . Embora esta técnica tenha suas semelhanças com o protocolo apresentado aqui, é novamente importante notar que nossa abordagem permite que o tecido permaneça intacto para a saúde das células. Aqui, apresentamos um protocolo para otimizarDessa aliança, que gera bibliotecas de célula única de alta qualidade para o uso de RNA-Seq para obter uma alta profundidade de leitura e cobertura de mapeamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso protocolo demonstra, através de um guia rápido e fácil de usar, um método para preparar células únicas de classes morfológicas identificadas para seqüenciamento de alta qualidade, com pouca lesão na amostra. No presente manuscrito, as células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis são morfologicamente caracterizadas, isoladas e preparadas para RNA-Seq. Podem ocorrer tensões celulares durante a manipulação da retina; Por esta razão, substituímos cada pedaço de tecido após não mai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Jennifer Bair e Einat Snir, bem como o Instituto de Genética Humana da Universidade de Iowa, por sua ajuda na preparação e manuseio de amostras.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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