En-cell-RNA-Seq av definierade deluppsättningar av retinala Ganglion-celler
Summary
Här presenterar vi ett kombinatoriskt tillvägagångssätt för att klassificera neuronala celltyper före isolering och för efterföljande karaktärisering av enkelcellstransskriptomer. Detta protokoll optimerar beredningen av prover för framgångsrik RNA-sekvensering (RNA-Seq) och beskriver en metod som är utformad speciellt för ökad förståelse av celldiversitet.
Abstract
Upptäckten av celltypsspecifika markörer kan ge insikt i cellulär funktion och ursprunget till cellulär heterogenitet. Med en nyhetstryck för den förbättrade förståelsen av neuronal mångfald är det viktigt att identifiera gener vars uttryck definierar olika subpopulationer av celler. Näthinnan tjänar som en utmärkt modell för studier av mångfald i centrala nervsystemet, eftersom den består av flera stora celltyper. Studien av varje större klass av celler har givit genetiska markörer som underlättar identifieringen av dessa populationer. Emellertid finns flera subtyper av celler inom var och en av dessa större retinala cellklasser, och få av dessa subtyper har känt genetiska markörer, fastän många har karakteriserats av morfologi eller funktion. Kunskap om genetiska markörer för enskilda retinala subtyper skulle möjliggöra studier och kartläggning av hjärnmål som är relaterade till specifika visuella funktioner och kan också ge insikt i de genenät somUpprätthålla cellulär mångfald. Nuvarande vägar som används för att identifiera de genetiska markörerna för subtyper har nackdelar, såsom klassificeringen av celltyper efter sekvensering. Detta utgör en utmaning för dataanalys och kräver rigorösa valideringsmetoder för att säkerställa att kluster innehåller celler med samma funktion. Vi föreslår en teknik för att identifiera en cells morfologi och funktionalitet före isolering och sekvensering, vilket möjliggör enklare identifiering av subtypsspecifika markörer. Denna teknik kan utvidgas till icke-neuronala celltyper, såväl som till sällsynta populationer av celler med mindre variationer. Detta protokoll ger utmärkta data, eftersom många av biblioteken har gett läsardjup större än 20 miljoner läser för enskilda celler. Denna metod övervinner många av de hinder som presenteras av encells RNA-Seq och kan vara lämpliga för forskare som syftar till att profilera celltyper på ett rakt och mycket effektivt sätt.
Introduction
Neuronal mångfald observeras i hela det centrala nervsystemet, särskilt i ryggradsnätet, en högspecialiserad vävnad bestående av 1 glial och 6 neuronala celltyper som uppstår från en population av retinala stamceller 1 , 2 , 3 . Många subtyper av celler kan klassificeras funktionellt, morfologiskt och genetiskt. Målet med detta protokoll är att binda cellernas typiska variabilitet till deras identifierbara funktionella och / eller morfologiska egenskaper. Ett antal gener har identifierats för klassificering av celler, men många subtyper fortsätter att vara okarakteriserade, eftersom de representerar en liten del av den totala populationen. Identifiering av gener inom dessa specifika subtyper kommer att möjliggöra en större förståelse för neuronal mångfald inom näthinnan och kan också kasta ljuset på diversifieringen av neurala celler på annat håll. FuDessutom möjliggör encellsstudier att upptäcka nya celltyper, vilket kan ha blivit förbisedda på grund av deras låga representation bland den totala populationen 4 , 5 , 6 , 7 .
En av fördelarna med encells transkriptomik är att unika markörer eller kombinationer av markörer som definierar en viss cellulär subtyp kan upptäckas. Dessa kan sedan användas för att få genetisk tillgång till den celltypen för olika manipuleringar. Till exempel använder vi detta protokoll för att karakterisera de celltypspecifika generna av en delmängd av retinala ganglionceller som uttrycker fotopigmentet melanopsin. Användningen av en fluorescerande markör i melanopsin-uttryckande retinala ganglionceller möjliggör studier av dessa celler, eftersom de kluster ihop på grund av deras uttryck av en känd gen. Intressant är det fem kända undertyper av denna cellpopuLation i muskelnätet 8 . För att isolera RNA från celler av varje typ har vi således använt etablerade morfologiska klassificeringar inom den transgena modellen för att identifiera varje subtyp före cellisolering. Denna teknik möjliggör karaktärisering av celler såväl som för deras isolering direkt från näthinnan, utan behov av vävsdissociation, vilket kan orsaka ett stressrespons inom celler och kontaminering på grund av avbrutna dendriter 9 .
En mängd nya tekniker har kommit fram under de senaste åren, eftersom RNA-Seq-metoden fortsätter att utvecklas. Dessa verktyg möjliggör maximalt cellförvärv och större kostnadseffektivitet när man närmar sig frågan 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Men medanDessa tekniker har varit utmärkta stegstenar, det finns ett antal hinder som fortfarande uppstår som detta protokoll kan adressera. För det första isolerar många av de aktuella procedurerna celler från dissocierad vävnad och försöker använda antingen huvudkomponentanalys eller hierarkisk clustering post-hoc för att bestämma cellklassificering. Att förlita sig på dessa verktyg för att klassificera undertyper kan inte ge tillförlitliga resultat och kan tvinga en att hitta nya sätt att validera denna data för korrelation av en genetisk markör till en funktionell celltyp. Kravet på dissociation i andra protokoll kan ibland resultera i vävnadsskada och kan orsaka att neuronprocesser avbryts, vilket resulterar i en potentiell förlust av mRNA. Dessutom kan spänningsreaktioner i dissocierade cellpreparat börja påverka transkriptomerna av dessa celler 14 . Detta protokoll övervinner dessa utmaningar genom att bestämma funktionell celltyp före isolering, och det bibehåller h bättreCellens hälsa genom att hålla näthinnan intakt.
En teknik infördes 2014 och bestod av in vivo analysen av transkriptomen av levande celler 15 . Medan denna teknik möjliggör undersökning av transkriptomen med minimal mekanisk störning i vävnaden saknar den förmågan att klassificera specifika celltyper i vävnaden innan man undersöker deras transkriptomer utan att använda en mycket specifik reportermus. Vårt protokoll kräver ingen specifik reporter, eftersom vi använder cellfyllning och elektrofysiologi för att karakterisera celler före isolering. En annan begränsning av detta tidigare protokoll är att det kräver en specifik våglängd för att excitera det fotoaktiverbara elementet, medan vårt protokoll tillåter användning av en fluorescerande reporter och fluorescerande färgämne, som är lättillgängliga eller kan väljas av varje laboratorium individuellt. Fortfarande har andra laboratorier gifte sig med de två metoderna för elektrOphysiologi och transkriptomik för studier av cellulär mångfald. Användningen av patch-clamp-inspelningar för att karakterisera funktionen hos en cell före dess isolering har utförts på dissocierade neuroner 16 och i vissa fall har den föregått användningen av mikroarrayanalys 17 för dessa studier. Samma komplikationer uppstår vid dessa tillvägagångssätt, eftersom de kräver vävnadsdissociation eller användningen av mikroarray-teknik, som bygger på hybridisering av prover till tillgängliga prober. En av de senaste framstegen har utvecklats av Patch-Seq, en teknik som kombinerar användningen av patch-clamp-inspelningar och RNA-Seq-teknik för att förstå celler från helhjärnskivor 18 . Medan denna teknik har likheter med protokollet som presenteras här är det återigen viktigt att notera att vårt tillvägagångssätt gör att vävnaden kan förbli intakt för cellernas hälsa. Här presenterar vi ett protokoll för optimizatJon av denna allians, som genererar högkvalitativa, encelliga bibliotek för användning av RNA-Seq för att erhålla ett högläst djup och kartläggningsskydd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt protokoll visar genom en snabb och användarvänlig guide en metod för att förbereda enskilda celler av identifierade morfologiska klasser för högkvalitativ sekvensering, med liten skada på provet. I det nuvarande manuskriptet karaktäriseras intrinsiskt ljuskänsliga retinala ganglionceller morfologiskt, isoleras och prepareras för RNA-Seq. Cellspänningar kan inträffa under retinalhantering; Av denna anledning byter vi varje bit av vävnad efter högst 4 timmars användning. Vi kan bedöma cellernas tills…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja erkänna Jennifer Bair och Einat Snir, liksom University of Iowa Institute for Human Genetics, för deras hjälp vid förberedelser och hantering av prover.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
