La purification d'affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
La purification de la protéine-protéine active et des complexes protéine-acide nucléique est cruciale pour la caractérisation des activités enzymatiques et la détermination de novo de nouvelles sous – unités et les modifications post-traductionnelles. Les systèmes bactériens permettent l'expression et la purification d'une grande variété de polypeptides simples et complexes protéiques. Cependant, ce système ne permet pas la purification des sous – unités protéiques qui contiennent des modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation et acétylation), et l'identification de nouvelles sous – unités régulatrices qui sont seulement présents / exprimées dans le système eucaryote. Ici, nous fournissons une description détaillée d'un roman, robuste et méthode efficace de purification par affinité en tandem (TAP) en utilisant streptomycine et des protéines FLAG-tagged qui facilite la purification de complexes protéiques avec transitoirement ou exprimé de manière stable des protéines de marquage épitopique à partir de cellules eucaryotes. Ce protocole peut être appliqué pour caractériser protein fonctionnalité complexe, pour découvrir les modifications post-traductionnelles sur des sous-unités complexes, et d'identifier de nouveaux composants réglementaires complexes par spectrométrie de masse. En particulier, cette méthode TAP peut être appliquée à l'étude des complexes protéiques formés par des composants ou eucaryotes pathogènes (virus et bactéries), ce qui donne ainsi un large éventail de possibilités expérimentales en aval. Nous proposons que les chercheurs travaillant avec des complexes de protéines pourraient utiliser cette approche dans de nombreuses façons différentes.
Introduction
Les interactions protéine-protéine (IPP) sont essentiels pour la régulation précise des processus biologiques 1, et d' autres études sur ces IPP peut indiquer leur fonction 2. Plusieurs approches ont été mises au point pour l'étude et la caractérisation des IPP, ainsi que pour l'identification de novo de nouveaux composants régulateurs protéiques. En 1989, les champs et les collègues Stanley a signalé la levure à deux hybrides (Y2H) dosage 3. Cette approche permet l'identification impartiale et complète de interacteurs (proies) pour une protéine d'intérêt définie (appât) dans Saccharomyces cerevisiae. En plus de son utilité pour la découverte remarquable PPIs, le dosage Y2H peut être utilisé pour caractériser des paires de protéines dans des cellules de levure, en définissant des domaines d'interaction minimale, et l'identification des mutations qui suppriment ces interactions. En modifiant le dosage de Y2H, IPP peut également être étudié dans des cellules de mammifèresclass = "xref"> 4. Les variations du dosage Y2H (par exemple, le système à trois hybrides de levure) peuvent également être appliqués à l' étude de protéines et d' ARN interactions ligand organique à petites protéines dans les cellules.
Un autre outil couramment utilisé pour étudier les IPP dans un système homologue est le co-immunoprécipitation (co-IP) dosage 5. En utilisant un anticorps à immunoprécipiter une protéine d'intérêt, le test de co-IP permet aux chercheurs de surveiller IPP dans le traitement des cellules pour diverses conditions environnementales et des situations expérimentales. L'utilisation de protéines de marquage épitopique (par exemple, FLAG, Myc, STREP, et HA, entre autres) dans la purification d'affinité (AP) méthodes a facilité l'isolement de protéines à partir de mélanges de protéines complexes pour plusieurs essais en aval, y compris western blot, tache d' argent et l'analyse enzymatique. Cependant, aucune de ces approches antérieures permettent l'isolement de grandes quantités de complexes de protéines pour une caractérisation ultérieure in vitro , y compris unssays, découverte de sous-unités régulatrices par spectrométrie de masse, et l'identification des modifications post-traductionnelles. Une version améliorée du procédé est appelé AP AP tandem (TAP), qui est une technique de purification pour l' étude des IPP en créant une protéine de fusion avec deux epitopes qui est purifié par deux points d' accès ultérieurs 6, 7. Dans cet article, nous présentons une variante de la méthode de TAP pour les complexes protéiques de purification dans lequel deux sous-unités sont marqués avec différents épitopes, puis purifiés par deux points d'accès séquentiels (STREP AP suivi par FLAG IP). Nous fournissons d' abord un aperçu de la TAP minimalistic (Figure 1), puis une description détaillée de toutes les étapes expérimentales (Figure 2), de sorte que les chercheurs puissent les appliquer à leur complexe de protéine d'intérêt.
Pour démontrer l'applicabilité de la méthode TAP, nous avons choisi une cycline-CDK bien caractérisé complexe (appelé PTEFB kinase), qui est composé de la cycline T1 de sous – unité régulatrice (CycT1) et une kinase (CDK9), et est impliqué dans la régulation de la transcription par l' ARN polymérase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphoryle le domaine C-terminal de Pol II et ses associés des facteurs d'élongation négative, ce qui soulage pause de la transcription au niveau du promoteur et facilite ainsi la transcription d' allongement 11, 12, 13. Avec cette interaction connue à l'esprit, STREP-tagged CycT1 et CDK9 FLAG marqués étaient surexprimés dans les cellules HEK293T. Une expérience TAP réciproque a été réalisée avec CDK9 et étiquetée FLAG étiquette strep CycT1 pour valider en outre que l'interaction des protéines est indépendante des épitopes utilisés. Les cellules ont été recueillies et lysées 48 heures après transfection. Le lysat soluble a été purifié par TAP (STREP AP suivie par FLAGIP). D' entrée et de protéines purifiées ont été analysées par Western Blot et coloration à l' argent (figure 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici pour l'expression et l'isolement des complexes de protéines à partir de cellules eucaryotes ne se limite pas à la caractérisation biochimique de ces assemblages moléculaires, mais il peut également être utilisé pour l'identification de nouveaux interacteurs et les modifications post-traductionnelles qui pourraient réguler leur fonctionnement. L'utilisation de marqueurs d'affinité ne se limite pas à ce qui est mentionné dans ce protocole; mais notre expérience mon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
