Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
Die Reinigung von aktivem Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexen ist von entscheidender Bedeutung für die Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten und de novo Identifizierung neuer Untereinheiten und post-translationalen Modifikationen. Bakterielle Systeme erlauben die für die Expression und Reinigung einer Vielzahl von einzelnen Polypeptide und Proteinkomplexen. Allerdings ist dieses System nicht die Reinigung von Protein – Untereinheiten ermöglichen , die post-translationale Modifikationen beinhalten (zB Phosphorylierung und Acetylierung) und die Identifizierung von neuen regulatorischen Untereinheiten , die nur present / ausgedrückt in der eukaryotischen System sind. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines neuen, robusten und effizienten tandem Affinitätsreinigung (TAP) Verfahren unter Verwendung von Strep- und FLAG-markierte Proteine, die die Reinigung von Proteinkomplexen mit transient oder stabil exprimiert erleichtert Epitop-markierten Proteinen aus eukaryontischen Zellen. Dieses Protokoll kann angewendet werden Prot zu charakterisierenein komplexer Funktionalität, zu entdecken, post-translationale Modifikationen an komplexen Untereinheiten und neuen Regulations komplexen Komponenten durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Bemerkenswert ist, kann diese TAP-Methode angewendet werden Proteinkomplexe durch eukaryotische oder pathogene (viral und bakteriell) Komponenten gebildet zu untersuchen, so dass eine Vielzahl von stromabwärts experimentellen Möglichkeiten ergibt. Wir schlagen vor, dass die Forscher mit Proteinkomplexen arbeiten in vielen verschiedenen Möglichkeiten, um diesen Ansatz nutzen können.
Introduction
Protein-Protein – Wechselwirkungen (PPIs) sind entscheidend für die genaue Regulierung der biologischen Prozesse 1, und weitere Studien auf diesen PPIs kann 2 um ihre Funktion zu informieren. Mehrere Ansätze wurden für die Untersuchung und Charakterisierung von EPI sowie für die de novo – Identifizierung neuer regulatorischer Proteinkomponenten entwickelt. Stanley Felder und Kollegen 1989, berichtete die Hefe – Zwei-Hybrid (Y2H) Test 3. Dieser Ansatz ermöglicht die unvoreingenommene und umfassende Identifizierung von Interaktoren (Beuten) für ein definiertes Protein von Interesse (Köder) in Saccharomyces cerevisiae. Neben der bemerkenswerten Nutzen für die Entdeckung PPIs kann der Y2H Assay zur Charakterisierung von Protein-Paare in Hefezellen verwendet werden, definieren eine minimale Interaktion Domänen und Identifizierung Mutationen, die derartige Wechselwirkungen aufheben. Durch Modifizieren der Y2H Assay kann PPIs auch in Säugerzellen untersucht werden,class = "xref"> 4. Variationen des Y2H Assay (zB Hefe Drei-Hybrid – System) kann auch zu studieren Protein-RNA und Protein-small organischen Liganden – Wechselwirkungen in Zellen angewendet werden.
Ein weiteres häufig verwendetes Werkzeug PPIs in einem homologen System zu studieren , ist die Co-Immunopräzipitation (Co-IP) Assay 5. Durch die Verwendung eines Antikörpers für ein Protein von Interesse zu immunpräzipitieren, erlaubt die Co-IP-Assay Forscher PPIs in Zellen für die verschiedenen Umgebungsbedingungen und experimentelle Situationen zu überwachen. Die Verwendung von Epitop-markierten Proteinen (zB FLAG, Myc, Strep, und HA, ua) in der Affinitätsreinigung (AP) Verfahren , um die Isolierung von Proteinen aus komplexen Proteingemischen für mehrere Downstream – Assays erleichtert hat, einschließlich Western – Blot, silver stain und enzymatische Analyse. Jedoch keiner dieser früheren Ansätze ermöglichen die Isolierung von großen Mengen an Protein – Komplexe zur weiteren Charakterisierung einschließlich in vitro assays, Entdeckung der regulatorischen Untereinheiten durch Massenspektrometrie, und Identifizierung von post-translationalen Modifikationen. Eine verbesserte Version des AP Methode Tandem AP (TAP) bezeichnet, die EPI für die Untersuchung durch die Schaffung eines Fusionsproteins mit zwei Epitope ein Reinigungsverfahren, das 6 bis zwei aufeinanderfolgende APs gereinigt wird, 7. In diesem Artikel stellen wir eine Variation des TAP Verfahren zur Reinigung von Protein-Komplexe, in denen zwei Untereinheiten mit unterschiedlichen Epitopen markiert werden und dann durch zwei aufeinanderfolgende APs (STREP AP gefolgt von einer FLAG IP) gereinigt. Wir bieten zunächst eine minimalistische Übersicht über TAP (Abbildung 1) und dann eine detaillierte Beschreibung aller experimentellen Schritte (Abbildung 2), so dass die Forscher sie auf ihre Proteinkomplex von Interesse anwenden können.
Um die Anwendbarkeit des TAP-Methode zu demonstrieren, haben wir uns für eine gut charakterisierte Cyclin-CDK-Komplex (bezeichnet als PTEFB – kinase), die aus der regulatorischen Untereinheit Cyclin T1 (CycT1) und eine kinase (CDK9) zusammengesetzt ist, und ist an der Regulation der Transkription durch RNA – Polymerase II (Pol II) 8, 9 beteiligt sind , 10. P-TEFb phosphoryliert die C-terminale Domäne von Pol II und den damit verbundenen negativen Elongationsfaktoren, die an der transkriptionalen Promotor Pausieren entlastet und erleichtert dadurch Transkriptionselongation 11, 12, 13. Bei dieser bekannten Interaktion im Auge, STREP-tagged CycT1 und FLAG-markierten CDK9 waren über in HEK293T-Zellen exprimiert. Eine reziproke TAP Experiment wurde mit Strep-tagged CDK9 und FLAG-markiertes CycT1 geführt weiter zu bestätigen, dass die Protein-Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Epitope. Die Zellen wurden gesammelt und lysiert 48 h nach der Transfektion. Das lösliche Lysat durch TAP gereinigt (STREP AP gefolgt von FLAGIP). Eingangs- und gereinigten Proteine wurden durch Western Blot und Silberfärbung (Abbildung 3) analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll für die Expression und Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen ist nicht auf die biochemische Charakterisierung solcher molekularen Anordnungen beschränkt, sondern kann auch für die Identifizierung von neuen Interaktoren und post-translationalen Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren könnte. Die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ist nicht beschränkt auf das, was in diesem Protokoll genannt wird; aber unsere Erfahrung legt nahe, dass STREP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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