从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
活性的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸复合物的纯化是用于酶活性和新颖性亚基和翻译后修饰的从头鉴定表征至关重要。细菌系统中允许的各种单个的多肽和蛋白复合物的表达和纯化。然而，该系统不使能包含翻译后修饰（ 例如 ，磷酸化和乙酰化）的蛋白质亚基的纯化，和新颖的调节亚基是只存在/在真核系统中表达的鉴定。在这里，我们提供一种新的，健壮的，并使用STREP-有效串联亲和纯化（TAP）方法和FLAG标签的蛋白质，有利于蛋白质复合物的纯化与来自真核细胞中瞬时或稳定表达表位标记的蛋白质的详细描述。此协议可应用到表征PROTEIN复杂的功能，以发现复杂亚基的翻译后修饰，并通过质谱分析法来识别新调节复杂的组件。值得注意的是，此TAP方法可用于研究真核或病原（病毒和细菌）组分形成蛋白复合物，从而产生一宽的下游实验机会阵列。我们建议，研究人员的蛋白质复合物的工作可以利用许多不同的方法这种方法。
Introduction
蛋白质-蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）是用于生物过程1，并在这些质子泵抑制剂进一步研究的精确调节临界可以告知他们的功能2。几种方法已被设计用于质子泵抑制剂的研究和表征以及用于新的调控蛋白组分的从头鉴定。 1989年，斯坦利领域和同事报道酵母双杂交（Y2H）检测3。这种方法允许在酿酒酵母作用因子（猎物）的定义的兴趣（诱饵）蛋白的公正和全面的鉴定。除了其用于发现质子泵抑制剂显着的效用，在Y2H测定可用于在酵母细胞中表征蛋白质对，限定最小相互作用域，以及识别废除这种相互作用的突变。通过修改Y2H测定中，质子泵抑制剂，也可在哺乳动物细胞中研究了类=“外部参照”> 4。在Y2H测定（ 如酵母三杂交系统）的变型也可以用于研究蛋白质的RNA，并在细胞中的蛋白质，小的有机配体的相互作用。
另一种常用的工具来研究质子泵抑制剂以同源系统是共免疫沉淀（共-IP）测定5。通过使用抗体免疫沉淀目的蛋白质，共同的IP测定使研究人员能够监测细胞对各种环境条件和实验条件质子泵抑制剂。使用表位标记的蛋白（ 例如 ，FLAG，Myc基因，STREP和HA，等等）在亲和纯化（AP）的方法，促进了从复合蛋白质混合物为几个下游测定法，包括免疫印迹蛋白质的分离，银染色的和酶分析。然而，这些以前的方法使能大量的蛋白质复合物的用于进一步表征，包括在体外在隔离ssays，通过质谱法，和翻译后修饰的识别调节亚基的发现。该AP方法的改进版本被称为串联的AP（TAP），这是通过创建与通过两个连续的AP 6,7纯化两个表位的融合蛋白研究质子泵抑制剂的纯化技术。在这篇文章中，我们提出了净化蛋白复合物，其中两个亚单位的标签与不同的表位，然后通过两个连续的AP（STREP AP随后FLAG IP）纯化TAP方法的变型。我们首先提供的TAP的一个简约概述（ 图1），然后所有的试验步骤的详细描述（ 图2），使得研究人员可以将它们应用到他们感兴趣的蛋白复合物。
为了证明在TAP方法的适用性，我们选择了一个良好表征细胞周期CDK络合物（简称PTEFB激酶），它是由所述调节亚基细胞周期蛋白T1（CycT1）和激酶（CDK9）的，并且是由RNA聚合酶II（RNA聚合酶II）8，9，10参与转录的调节。 P-TEFB磷酸聚合酶II和其相关联的消极延伸因子，这在启动子减轻转录暂停的C-末端结构域，并由此促进转录延伸11，12，13。考虑到这一众所周知的互动，STREP标记CycT1和FLAG标记CDK9均超过在HEK293T细胞中表达。互惠TAP实验与STREP标记CDK9和FLAG标记CycT1进行进一步验证该蛋白质相互作用是独立使用的表位。收集细胞并裂解48小时后转染。 （AP STREP之后FLAG的可溶性裂解液纯化TAPIP）。输入和纯化蛋白通过Western印迹和银染色（ 图3）分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处所描述的表达和从真核细胞中的蛋白质复合物的分离的协议不限于这样的分子组件的生化特性，但也可用于新的交互件和翻译后修饰，可以调节它们的功能的识别。亲和标签的使用并不限于是什么在这个协议中提到;但我们的经验表明，使用STREP作为第一个AP步骤显著增强了最终蛋白质 – 蛋白质复合物的产率。都与其它表位标签（ 例如 ，FLAG）相比，距离STREP珠的结合和洗脱步骤是非常有…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
