Intracellular धुंधला और फ्लो का उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine महाधमनी, किडनी और लिम्फ नोड्स के भीतर लिम्फोसाइट सबसेट की पहचान करने के लिए
Summary
इस लेख की पहचान करने और कार्यात्मक टी लिम्फोसाइट intracellular धुंधला द्वारा murine गुर्दे, महाधमनी और लिम्फ नोड्स के भीतर मौजूद सबसेट यों और प्रवाह cytometry करने के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है। एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के मॉडल, समझा कदम-दर-कदम है, प्रक्रियाओं और प्रवाह cytometry के मौलिक सिद्धांतों और intracellular धुंधला करने के लिए चुना गया था।
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
हाल ही में सबूत यह दर्शाता है कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, विशेष रूप से टी lymphocytes, कई हृदय रोगों 1,2,3,4,5 के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के मॉडल में, बर्तन और चूहों के गुर्दे में टी कोशिकाओं का एक संग्रह 6 वर्णित किया गया है। संवहनी संचय adventitia और परिवाहकीय वसा में मुख्य रूप से है। गुर्दे में, टी कोशिकाओं दोनों मज्जा और गुर्दे कोर्टेक्स में जमा है। पर जो सबसेट शामिल है निर्भर करता है, इन टी कोशिकाओं अलग साइटोकिन्स कि नाड़ी और गुर्दे समारोह को प्रभावित और विकृति के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं को जन्म दे (मैकमास्टर एट अल। 6 द्वारा समीक्षा)।
सीडी 4+ टी सहायक लिम्फोसाइटों कई सबसेट में बांटा जा सकता है: टी सहायक 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, टी नियामक (Treg) कोशिकाओं, और टी कूपिक सहायक (Tfh) उनके कार्यों और हस्ताक्षर Cyto के आधार पर कोशिकाओंkines 7। इसी तरह, सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं TC1, TC2, Tc17 या TC9 8 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। वहाँ भी डबल नकारात्मक टी कोशिकाओं (यानी कोशिकाओं है कि सीडी 4 या सीडी 8 टी सेल मार्कर व्यक्त नहीं करते) हैं। इन कोशिकाओं के एक सबसेट एक वैकल्पिक गामा डेल्टा टी सेल रिसेप्टर (बजाय शास्त्रीय अल्फा और बीटा रिसेप्टर्स) के अधिकारी और इसलिए गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। सतह मार्कर, साइटोकाइन और प्रतिलेखन कारक के प्रवाह cytometry द्वारा मल्टी पैरामीटर विश्लेषण सबसे अच्छा तरीका इन कोशिकाओं की पहचान करने का गठन किया। हालांकि इस पद्धति बड़े पैमाने पर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है, यह कम अच्छी तरह से ठोस अंगों में और हृदय रोगों की स्थापना में वर्णित है।
ऐतिहासिक दृष्टि से, ऊतकों में लिम्फोसाइट की पहचान immunohistochemistry या आरटी पीसीआर दृष्टिकोण तक ही सीमित था। हालांकि immunohistochemistry और immunofluorescence शक्तिशाली तरीकों int के एक प्रतिजन के ऊतक वितरण निर्धारित कर रहे हैंerest, वे phenotypically शामिल सबसेट की पहचान करने के लिए अपर्याप्त हैं। इसके अलावा, जबकि आरटी पीसीआर विश्लेषण एंटीजन, साइटोकिन्स या प्रतिलेखन कारक के mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए उपयोगी है, यह कई प्रोटीन का पता लगाने के साथ-साथ व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर अनुमति नहीं है।
प्रवाह के आगमन cytometry, खासकर जब intracellular धुंधला के साथ संयुक्त साइटोकिन्स और प्रतिलेखन कारक पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है कि ठोस अंगों में प्रतिरक्षा सेल सबसेट के एकल कोशिका के स्तर पर पहचान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है। हम प्रमुख टी सेल एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine गुर्दे, महाधमनी और महाधमनी draining लिम्फ नोड्स के भीतर मौजूद सबसेट प्रवाह cytometry द्वारा की पहचान के लिए एक intracellular धुंधला परख अनुकूलित है। प्रत्येक चरण के अनुकूलन: ऊतक पाचन, पूर्व vivo सक्रियण, permeabilization, और सतह और intracellular धुंधला परिणामों में एक अत्यधिक फिर सेproducible परख है कि अन्य हृदय और गुर्दे की बीमारी के मॉडल को लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के फ्लोरिडा में एक अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप अवार्ड (16POST29950007), स्वास्थ्य (एनआईएच T32 HL069765) BLD, एमए सालेह के लिए एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप अवार्ड (14POST20420025) के राष्ट्रीय संस्थानों से एक प्रशिक्षण अनुदान, और एक एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया K08 पुरस्कार एमएसएम के लिए (HL121671)। एमएसएम भी गिलाद विज्ञान, इंक से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित है
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
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