بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي لتحديد الخلايا الليمفاوية مجموعات فرعية ضمن الفئران الأورطي، الكلى والغدد الليمفاوية في نموذج من ارتفاع ضغط الدم
Summary
وتنص هذه المادة منهجية مفصلة لتحديد وقياس وظيفية فرعية T اللمفاوية موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والغدد الليمفاوية عن طريق تلطيخ الخلايا والتدفق الخلوي. وقد تم اختيار نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم عن لشرح، خطوة بخطوة، والإجراءات والمبادئ الأساسية للالتدفق الخلوي وتلطيخ الخلايا.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
وتفيد أحدث البيانات أن نظام المناعة على التكيف، وخاصة الخلايا الليمفاوية T، تلعب دورا حاسما في تطوير العديد من الأمراض القلبية الوعائية 1،2،3،4،5. على سبيل المثال، في نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم، وقد وصفت تراكم خلايا T في الأوعية والكلى من الفئران 6. تراكم الأوعية الدموية في الغالب في البرانية والدهون ماحول الأوعية. في الكلى، وخلايا T تتراكم في كل من النخاع والقشرة الكلوية. اعتمادا على مجموعة فرعية تشارك هذه الخلايا T تثير السيتوكينات المختلفة التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الأوعية الدموية والكلى ويؤدي إلى تطوير علم الأمراض (التي استعرضتها ماكماستر وآخرون. 6).
ويمكن تقسيم CD4 + T الخلايا الليمفاوية المساعدة إلى عدة مجموعات فرعية: T المساعد 1 (TH1)، TH2، Th9، Th17، Th22، تي التنظيمية (Treg) الخلايا، وتي المساعد الجريبي (مرفأ تونس المالي) الخلايا استنادا مهامهم وخلوي توقيعkines 7. وبالمثل، خلايا CD8 + التائية السامة يمكن أن تصنف على أنها TC1، TC2، Tc17 أو Tc9 8. وهناك أيضا مزدوجة خلايا T السلبية (أي الخلايا التي لا تعبر عن CD4 أو علامات الخلية التائية CD8). مجموعة فرعية من هذه الخلايا تمتلك لجاما دلتا مستقبلات الخلايا التائية البديل (بدلا من الكلاسيكية ألفا ومستقبلات بيتا)، وبالتالي يشار اليها على أنها جاما دلتا خلايا تي. تحليل متعددة المعلمة بواسطة التدفق الخلوي من علامة السطح، خلوى وعامل النسخ يشكل أفضل نهج لتحديد هذه الخلايا. على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب على نطاق واسع في مجال علم المناعة، فإنه يوصف بشكل أقل في الأجهزة الصلبة وفي تحديد أمراض القلب والأوعية الدموية.
تاريخيا، وتحديد الخلايا الليمفاوية في الأنسجة اقتصر على المناعية أو النهج RT-PCR. على الرغم من أن المناعية والمناعي وطرق قوية لتحديد توزيع الأنسجة من مستضد من كثافة العملياتerest، فهي غير كافية لتحديد النمط الظاهري المجموعات الفرعية المعنية. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن تحليل RT-PCR هو مفيد للكشف عن التعبير مرنا من المستضدات، السيتوكينات أو عوامل النسخ، فإنه لا يسمح للكشف عن البروتينات متعددة في وقت واحد على مستوى الخلايا الفردية.
ظهور التدفق الخلوي، وخصوصا عندما يقترن تلطيخ الخلايا للكشف عن السيتوكينات وعوامل النسخ، ويقدم المحققون مع تقنية قوية تسمح بتحديد وتقدير على مستوى خلية واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية في الأعضاء الصلبة. لقد الأمثل مقايسة تلطيخ الخلايا لتحديد التدفق الخلوي مجموعات فرعية الخلايا التائية الكبرى موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في نموذج للأنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم. الاستفادة المثلى من كل خطوة: الهضم الأنسجة، خارج الحي التنشيط، permeabilization، والسطحية والنتائج تلطيخ الخلايا في إعادة للغايةفحص producible التي يمكن تطبيقها على نماذج مرض القلب والأوعية الدموية والكلى أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة القلب الأمريكية جمعية زمالة (16POST29950007) إلى فلوريدا، منحة التدريب من المعاهد الوطنية للصحة (NIH T32 HL069765) إلى بناية، وهي جائزة جمعية زمالة القلب الأمريكية (14POST20420025) لMA صالح، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K08 (HL121671) لسوق مسقط. ويدعم MSM أيضا منحة بحثية من العلوم جلعاد، وشركة
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
