Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension
Summary
Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Recent bewijs toont aan dat het adaptieve immuunsysteem, met name T-lymfocyten een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van verscheidene cardiovasculaire aandoeningen 1,2,3,4,5. Bijvoorbeeld, in het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie, een accumulatie van T-cellen in de bloedvaten en nieren van muizen is beschreven 6. De vasculaire accumulatie overwegend adventitia en de perivasculaire vet. In de nier T-cellen ophopen in zowel de medulla en renale cortex. Afhankelijk van welke subset betrokken, deze T-cellen geven aanleiding tot verschillende cytokines die invloed kunnen hebben vasculaire en renale functie en leiden tot de ontwikkeling van de pathologie (beoordeeld door McMaster et al. 6).
CD4 + T-helper lymfocyten kunnen worden onderverdeeld in verschillende subgroepen: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regulatoire T (Treg) cellen, folliculaire en T helper (Tfh) cellen op basis van hun functie en handtekening cytokines 7. Evenzo kunnen CD8 + cytotoxische T-cellen worden ingedeeld Tc1, Tc2, Tc17 of TC9 8. Er zijn ook een dubbele negatieve T-cellen (dwz cellen die de CD4 of CD8 T-cel markers tot expressie brengen). Een subgroep van deze cellen bezitten een alternatieve gamma delta T-celreceptor (in plaats van de klassieke alfa- en beta-receptoren) en derhalve als gamma delta T-cellen genoemd. Het multiparameter analyse met flowcytometrie van oppervlaktemerker, cytokine- en transcriptiefactor vormt de beste manier om deze cellen te identificeren. Hoewel deze methode op grote schaal wordt gebruikt op het gebied van de immunologie is het minder goed beschreven in vaste organen en bij de vaststelling van hart- en vaatziekten.
Historisch gezien is de identificatie van lymfocyten in weefsel beperkt tot immunohistochemie en RT-PCR benadering. Hoewel immunohistochemie en immunofluorescentie zijn krachtige methoden om de weefselverdeling van een antigeen int bepalenerest, ze zijn ontoereikend om de subsets betrokken fenotypisch identificeren. Bovendien, terwijl de RT-PCR is handig om mRNA expressie van antigenen, cytokinen of transcriptiefactoren sporen, het niet de detectie van meerdere eiwitten gelijktijdig kunnen op het niveau van individuele cellen.
De komst van flowcytometrie, vooral in combinatie met intracellulaire kleuring cytokinen en transcriptiefactoren detecteren, geeft onderzoekers een krachtige techniek die de identificatie en kwantificering toelaten aan de enkele cel niveau van immuuncelsubklassen in vaste organen. We hebben een intracellulaire kleuring assay te bepalen met stroomcytometrie grote T cel subsets aanwezig in nieren van muizen, aorta en aorta drainerende lymfeklieren in een model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie geoptimaliseerd. Optimalisering van elke stap: weefsel spijsvertering, ex vivo activering, permeabilisatie en oppervlak en intracellulaire kleuring leidt tot een zeer reproduceerbaar test die kan worden toegepast op andere cardiovasculaire en renale ziekte modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) naar Florida, een opleiding subsidie van de National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) naar BLD, een American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) naar MA Saleh, en een NIH K08 award (HL121671) naar MSM. MSM wordt ook ondersteund door een onderzoek subsidie van Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
