Summary

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l'hypertension

Published: January 28, 2017
doi:

Summary

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l'aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l'angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.

Abstract

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introduction

Des données récentes démontrent que le système immunitaire adaptatif, en particulier les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires 1,2,3,4,5. Par exemple, dans le modèle de l' angiotensine II , l' hypertension induite par une accumulation de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins de souris a été décrite 6. L'accumulation vasculaire est principalement dans l'adventice et la graisse périvasculaire. Dans le rein, les cellules T accumulent à la fois dans la moelle et le cortex rénal. Selon le type de sous – ensemble est en cause, ces cellules T donnent naissance à différentes cytokines qui peuvent affecter la fonction vasculaire et rénale et conduire au développement de la pathologie (revue par McMaster et al. 6).

Lymphocytes T auxiliaires CD4 + peuvent être divisés en plusieurs sous – ensembles: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, TH22, (Treg) T régulatrices, et T helper folliculaire (TFH) des cellules en fonction de leurs fonctions et signature cytokines 7. De même, les cellules T cytotoxiques CD8 + peuvent être classés comme Tc1, Tc2, TC17 ou 8 TC9. Il existe également des cellules T doubles négatives ( par exemple des cellules qui ne manifestent pas les marqueurs CD4 ou des lymphocytes T CD8). Un sous-ensemble de ces cellules possèdent un récepteur alternatif gamma delta T cellulaire (au lieu des récepteurs alpha et bêta classiques) et sont donc appelées cellules T gamma delta. L'analyse multi-paramètres par cytométrie de flux de marqueur de surface, cytokine et facteur de transcription constitue la meilleure approche pour identifier ces cellules. Bien que cette méthode est largement utilisée dans le domaine de l'immunologie, il est moins bien décrite dans les organes solides et dans le cadre des maladies cardiovasculaires.

Dans le passé, l'identification des lymphocytes dans les tissus a été limitée à l'immunohistochimie ou des approches de RT-PCR. Bien que immunohistochimie et immunofluorescence des procédés puissants afin de déterminer la distribution tissulaire d'un antigène d'intEREST, ils sont insuffisants pour identifier les sous-ensembles phénotypique impliqués. En outre, alors que l'analyse par RT-PCR permet de détecter l'expression des ARNm des antigènes, des cytokines ou des facteurs de transcription, elle ne permet pas la détection de protéines multiples simultanément au niveau des cellules individuelles.

L'avènement de la cytométrie en flux, en particulier lorsqu'elle est combinée avec la coloration intracellulaire pour détecter des cytokines et des facteurs de transcription, donne des chercheurs ayant une puissante technique qui permet l'identification et la quantification au niveau de la cellule unique de sous-ensembles de cellules immunitaires dans des organes solides. Nous avons optimisé un essai de coloration intracellulaire pour identifier par cytométrie de flux les principaux sous-ensembles de cellules T présents dans le rein de souris, l'aorte et l'aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l'angiotensine II, l'hypertension induite. L'optimisation de chaque étape: la digestion du tissu, ex vivo activation, perméabilisation, et la surface et les résultats de coloration intracellulaire dans un très nouveauproductible dosage qui peut être appliqué à d'autres modèles de maladies cardiovasculaires et rénales.

Protocol

Comité des soins et l'utilisation institutionnelle des animaux de l'Université Vanderbilt a approuvé les procédures décrites ici. Les souris sont logés et soignés conformément au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Revised 2010). 1. Isolement de l'Aortic Vidange Adénopathies, Reins et Aorte de souris Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. Pulvériser la poitrine avec 70% d'éthanol et ouvrir avec pr…

Representative Results

Le protocole décrit permet l'identification de marqueurs de surface et intracellulaires dans les cellules T isolées de rein de souris, de l'aorte et de l'aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l'angiotensine II, l'hypertension induite. Les résultats représentatifs sont présentés ci-dessous. La figure 1 illustre la stratégie de portillonnage utilisé pour identifier …

Discussion

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par un prix de l'American Heart Association Fellowship (16POST29950007) FL, une bourse de formation de la National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) à BLD, un prix de l'Association Fellowship American Heart (14POST20420025) à MA Saleh, et une NIH K08 prix (HL121671) au MSM. MSM est également soutenu par une subvention de Gilead Sciences, Inc. recherche

Materials

Collagenase D ROCHE 11088882001
Collagenase A ROCHE 10103586001
Collagenase B ROCHE 11088815001
Dnase ROCHE 10104159001
1X Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RPMI Medium 1614 1X Gibco 11835-030
DPBS without calcium and magnesium Gibco 14190-144
Percoll GE Healthcare 17-5445-02 For density gradient centrifugation
GentleMACS ™ C tube  Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A) Biolegend 423303
anti-CD16/32 eBioscience 14-0161-81 dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Life Technologies L34955
Transcription factor buffer set BD Pharmingen 562725
OneComp eBeads  eBioscience 01-1111-42
123 count eBeads eBioscience 01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11) BioLegend 103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) BioLegend 100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) BioLegend 506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8) BioLegend 517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) BD Biosciences 560181
CD8 APC (clone 53-67) eBioscience 17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) BioLegend 644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2) BD Biosciences 557724

References

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Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. J. Vis. Exp. (119), e55266, doi:10.3791/55266 (2017).

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