Summary

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l'identificazione dei linfociti sottoinsiemi all'interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

Published: January 28, 2017
doi:

Summary

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per identificare e quantificare i sottoinsiemi dei linfociti T funzionali presenti all'interno dei nodi del rene murino, aorta e linfatici mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Il modello di angiotensina II ipertensione indotta è stato scelto per spiegare, passo-passo, le procedure ei principi fondamentali della citometria a flusso e colorazione intracellulare.

Abstract

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introduction

Recenti evidenze dimostra che il sistema immunitario adattativo, in particolare i linfociti T, giocano un ruolo fondamentale nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari 1,2,3,4,5. Ad esempio, nel modello di angiotensina II ipertensione indotta, un accumulo di cellule T nei vasi e nei reni dei topi è stato descritto 6. L'accumulo vascolare è prevalentemente nel avventizia e il grasso perivascolare. Nel rene, cellule T accumulano sia midollo e corteccia renale. A seconda di quale sottoinsieme è coinvolto, queste cellule T danno luogo a diverse citochine che possono influenzare la funzione vascolare e renale e portare allo sviluppo della patologia (recensione da McMaster et al. 6).

Linfociti T helper CD4 + possono essere suddivisi in diversi sottogruppi: cellule (TFH) T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regolatori (Treg), le cellule T, e T helper follicolare in base alle loro funzioni e la firma citokines 7. Allo stesso modo, le cellule CD8 + T citotossici possono essere classificati come Tc1, Tc2, TC17 o TC9 8. Ci sono anche doppie cellule T negative (cioè le cellule che non esprimono CD4 o marcatori cellulari T CD8). Un sottoinsieme di queste cellule possiedono una gamma delta recettore delle cellule T alternativo (al posto dei classici alfa e beta recettori) e sono quindi indicato come cellule T gamma delta. L'analisi multi-parametro mediante citometria di flusso del marcatore di superficie, citochine e fattori di trascrizione costituisce l'approccio migliore per identificare queste cellule. Anche se questo metodo è ampiamente usato nel campo della immunologia, è meno ben descritto in organi solidi e nel contesto delle malattie cardiovascolari.

Storicamente, l'identificazione dei linfociti nei tessuti era limitato a immunoistochimica o approcci RT-PCR. Sebbene immunoistochimica e immunofluorescenza sono metodi efficaci per determinare la distribuzione tissutale di un antigene di interest, essi sono inadeguati per identificare fenotipicamente i sottoinsiemi coinvolti. Inoltre, mentre l'analisi RT-PCR è utile per rilevare l'espressione mRNA di antigeni, citochine o fattori di trascrizione, non permette la rilevazione di più proteine ​​simultaneamente a livello delle singole cellule.

L'avvento della citometria a flusso, specialmente se combinata con la colorazione intracellulare per rilevare citochine e fattori di trascrizione, fornisce gli investigatori con una tecnica potente che permette l'identificazione e la quantificazione a livello di singola cellula di sottoinsiemi di cellule immunitarie in organi solidi. Abbiamo ottimizzato un test colorazione intracellulare per identificare mediante citometria di flusso principali sottogruppi di cellule T presenti nel rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. L'ottimizzazione di ogni fase: la digestione dei tessuti, ex vivo di attivazione, permeabilizzazione, e la superficie e risultati di colorazione intracellulare in un grande retest producibile che può essere applicato ad altri modelli di malattie cardiovascolari e renali.

Protocol

Comitato Cura e uso istituzionale degli animali del Vanderbilt University ha approvato le procedure descritte nel presente documento. I topi sono alloggiati e curati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. Revised 2010). 1. L'isolamento della Drenante aortica linfonodi, reni e aorta di topi Euthanize i topi da CO 2 inalazione. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo e aprire con cautela la pelle e la parete toracica con l…

Representative Results

Il protocollo consente descritto l'identificazione di marcatori di superficie ed intracellulari in cellule T isolate dal rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. I risultati rappresentativi sono presentati di seguito. La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzato per identificare la popolazione di cellule T in una sospensione di cellule s…

Discussion

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un'associazione Fellowship Award American Heart (16POST29950007) per FL, una borsa di formazione da parte del National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) a BLD, un'associazione Fellowship Award American Heart (14POST20420025) per MA Saleh, e di un NIH premio K08 (HL121671) per MSM. MSM è anche supportato da un assegno di ricerca da Gilead Sciences, Inc.

Materials

Collagenase D ROCHE 11088882001
Collagenase A ROCHE 10103586001
Collagenase B ROCHE 11088815001
Dnase ROCHE 10104159001
1X Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RPMI Medium 1614 1X Gibco 11835-030
DPBS without calcium and magnesium Gibco 14190-144
Percoll GE Healthcare 17-5445-02 For density gradient centrifugation
GentleMACS ™ C tube  Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A) Biolegend 423303
anti-CD16/32 eBioscience 14-0161-81 dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Life Technologies L34955
Transcription factor buffer set BD Pharmingen 562725
OneComp eBeads  eBioscience 01-1111-42
123 count eBeads eBioscience 01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11) BioLegend 103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) BioLegend 100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) BioLegend 506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8) BioLegend 517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) BD Biosciences 560181
CD8 APC (clone 53-67) eBioscience 17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) BioLegend 644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2) BD Biosciences 557724

References

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Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. J. Vis. Exp. (119), e55266, doi:10.3791/55266 (2017).

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