Использование синтетической биологии инженеру живых клеток, которые взаимодействуют с программируемыми материалов
Summary
Эта статья представляет собой серию протоколов для разработки сконструированных клеток и функционализированных поверхности , которые дают возможность синтетически сконструированных E.coli , чтобы контролировать и управлять программируемыми поверхности материалов.
Abstract
Мы разработали абиотическую-биотических интерфейс, который позволяет сконструированные клетки контролировать свойства материала функционализированного поверхности. Эта система сделана путем создания двух модулей: синтетически сконструированного штамма клеток E.coli и функционализированный интерфейс материала. В этой статье мы подробно протокол для генной инженерии выбранного поведения в пределах штамма E.coli , при использовании стратегий молекулярного клонирования. После разработки, этот штамм продуцирует повышенные уровни биотина при воздействии химического индуктора. Кроме того, мы подробно протоколы для создания двух различных функционализированных поверхностей, каждая из которых способна реагировать на клетки синтезированный биотина. Взятые вместе, мы представляем методологию для создания связанного, абиотическую-биотических система, которая позволяет сконструированные клетки для контроля состава материала и сборки на неживых субстратах.
Introduction
Мы сообщаем процедуры разработки программируемую субстрат, способный реагировать на химический сигнал от сконструированного клеточной линии. 1 Мы делаем это путем создания биотин-стрептавидин интерфейс , который реагирует с биотином получают синтетически сконструированного Escherichia coli (E.coli) клетках. Ранее программируемые поверхности были разработаны для широкого спектра применений от обнаружения токсина 2 и пункт-ухода диагностики 3 обороны и безопасности. 4 В то время как программируемые поверхности могут быть использованы в качестве датчиков и исполнительных устройств, они могут быть сделаны "умнее" , наделяя их способностью приспосабливаться к различным экологическим проблемам. В отличие от этого , даже простые микроорганизмы, такие как E.coli, имеют присущую адаптивность и способны реагировать на вызовы со сложными и зачастую неожиданные решения. Эта адаптивность позволила Е.популяции Coli, под контролем их сложных генных сетей, экономически эффективно изыскивать ресурсы, 5 создавать продукты с добавленной стоимостью, 6 и даже мощности микро-масштаба робототехники. 7 сочетанием адаптивных преимуществ живых клеток с использованием программируемых поверхностей, мы можем создать смарт – субстрат , способный реагировать на различных условиях окружающей среды.
Синтетическая биология дала исследователям новые способности программировать поведение живых организмов. Машиностроительным клетки содержат новый ген регуляторных сетей, исследователи могут конструировать клетки, которые демонстрируют целый ряд запрограммированных форм поведения. 8, 9 Помимо фундаментальных исследований, эти модели поведения могут быть использованы для приложений , таких как управление Сборочный материал и биологически производства продукции с высокой добавленной стоимостью. 10 Здесь мы подробно , как мы использовали инструменты синтетической биологии для ваннойgineer штамм E.coli , который синтезирует биотин при индукции. Этот штамм был разработан с использованием методов фермента рестрикции клонирования для сборки плазмиды, pKE1-Лачи-bioB. Эта плазмида, когда трансформировали в E.coli штамм К-12 MG1655, жертвует клетки со способностью выражать повышенные уровни bioB, жизненно важного фермента для синтеза биотина. Когда трансформированные клетки индуцировали изопропиловым бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и при условии, с предшественником биотин, desthiobiotin (DTB), были получены повышенные уровни биотина.
связывающее взаимодействие биотин с стрептавидином является одним из самых сильных нековалентных связей, существующих в природе. Таким образом, взаимодействие биотин-стрептавидин и хорошо охарактеризованных и высоко занятых в области биотехнологии. 11 В рамках этой рукописи мы представляем две стратегии , использующие взаимодействие биотин-стрептавидин чувствовать и обнаруживать клеток производства биотина с функционализированного поверхностью. Мыотносятся к этим контрастных поверхностей, как «косвенные» и «прямых» схем управления. В косвенном схеме управления, клетка производства биотин конкурирует с биотином, который был конъюгированным и иммобилизованного на поверхности полистирола для стрептавидина-сайтов. Кроме того, стрептавидин конъюгирован с пероксидазой хрена (HRP). ПХ изменяет 3, 3 ', 5, 5'-тетраметилбензидином (ТМВ), для получения оптического сигнала, 12 , которые могут быть проверены количественной оценки спектральной поглощательной (т.е. оптической плотности) при 450 нм (OD 450). Таким образом, косвенная схема управления позволяет исследователям измерять клеток производства биотин путем мониторинга затуханием сигнала OD 450.
Схема прямого управления использует стрептавидин-биотин событие иммобилизацией стрептавидин непосредственно к поверхности материала и позволяя клеток производства биотина и биотинилированного HRP, чтобы конкурировать за сайты связывания стрептавидина. Опять же,Относительные уровни клеточного производства биотина контролируются путем измерения сигнала OD 450.
Взятые вместе, сконструированные клетки и функционализованные поверхности позволяют нам контролировать свойства программируемой поверхности путем индуцирования сетей в живых клетках. Другими словами, мы создали систему, которая использует преимущества приспособляемости живых организмов и надежности и спецификации сконструированной интерфейса материала, связывая эти системы вместе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили новую стратегию для взаимодействия сконструированных живых клеток с функциональными группами поверхности материала. Это было достигнуто путем разработки клеточной линии, способной синтезировать повышенные уровни биотина при индуцированных IPTG. Повышенные уровни био?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность поддержку от премии FA9550-13-1-0108 от Управления ВВС научных исследований США. Авторы дополнительно признают поддержку от премии N00014-15-1-2502 из Управления военно-морских исследований США, финансирование из Института важнейших технологий и прикладных наук в Вирджинии политехнического института и государственного университета, а также от Национального научного фонда Graduate исследований Программа стипендий, награда номер 1607310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
