Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili
Summary
Questo documento presenta una serie di protocolli per lo sviluppo di cellule ingegnerizzate e superfici funzionalizzate che consentono sinteticamente progettati E. coli di controllare e manipolare superfici materiche programmabili.
Abstract
Abbiamo sviluppato un'interfaccia abiotico-biotici che permette alle cellule ingegnerizzate per controllare le proprietà del materiale di una superficie funzionalizzata. Questo sistema è composto creando due moduli: un ceppo sinteticamente stratificato di cellule di E. coli e un'interfaccia materiale funzionalizzato. All'interno di questo documento, i dettagli di un protocollo per l'ingegneria genetica comportamenti selezionati all'interno di un ceppo di E. coli che utilizzano strategie di clonazione molecolare. Una volta sviluppato, questo ceppo produce livelli elevati di biotina quando esposti ad un induttore chimico. Inoltre, noi dettaglio protocolli per creare due superfici funzionalizzate differenti, ognuno dei quali è in grado di rispondere alla biotina cellule sintetizzato. Nel loro insieme, presentiamo una metodologia per la creazione di un sistema collegato, abiotici-biotici che permette progettato cellule per controllare la composizione dei materiali e il montaggio su substrati non viventi.
Introduction
Qui, si riportano le procedure per sviluppare un substrato programmabile capace di rispondere ad un segnale chimico da una linea cellulare ingegnerizzata. 1 Facciamo questo con la creazione di una interfaccia biotina-streptavidina che risponde alla biotina prodotta da coli sinteticamente ingegnerizzato Escherichia (E. coli) cellule. In precedenza, le superfici programmabili sono stati progettati per una vasta gamma di applicazioni, dalla rilevazione della tossina 2 e point-of-care diagnosi 3 di difesa e sicurezza. 4 Mentre superfici programmabili possono essere utili come sensori e attuatori, possono essere fatti "intelligenti" di dotandoli la capacità di adattarsi a differenti sfide ambientali. Al contrario, anche microrganismi semplici, come E. coli, hanno adattabilità intrinseca e sono in grado di rispondere alle sfide con soluzioni sofisticate e spesso inaspettati. Questa capacità di adattamento ha permesso E.popolazioni coli, controllate dai loro reti geniche complesse, a costi contenuti cercare risorse, 5 creare prodotti a valore aggiunto, 6 e perfino la robotica micro-scala di potenza. 7 Accoppiando i vantaggi adattivi di cellule viventi con l'uso di superfici programmabili, possiamo creare un substrato intelligente in grado di rispondere alle diverse condizioni ambientali.
Biologia sintetica ha dato ricercatori nuove capacità di programmare il comportamento degli organismi viventi. Da Engineering cellule di contenere reti di regolazione nuovo gene, i ricercatori possono progettare le cellule che presentano una serie di comportamenti programmati. 8, 9 Al di là della ricerca di base, questi comportamenti possono essere utilizzati per applicazioni come il controllo assemblaggio materiale e biologicamente la produzione di prodotti a valore aggiunto. 10 Qui, abbiamo dettaglio come abbiamo utilizzato gli strumenti della biologia sintetica per itgineer un ceppo di E. coli che sintetizza biotina su di induzione. Questo ceppo è stato sviluppato utilizzando metodi enzima di restrizione di clonazione per assemblare un plasmide, pKE1-lacI-bioB. Questo plasmide, quando trasformato in ceppo di E. coli K-12 MG1655, conferisce cellule con la capacità di esprimere livelli elevati di bioB, un enzima essenziale per la sintesi biotina. Quando le cellule trasformate sono state indotte con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e provvisto di un precursore biotina, desthiobiotin (DTB), sono stati prodotti livelli elevati di biotina.
interazione Legame di biotina con streptavidina è uno dei più forti legami non covalenti presenti in natura. Come tale, l'interazione biotina-streptavidina è sia ben caratterizzati e altamente impiegati in biotecnologia. 11 All'interno di questo manoscritto, presentiamo due strategie che impiegano l'interazione biotina-streptavidina per rilevare e rilevare biotina cellule-prodotto con una superficie funzionalizzata. Noifare riferimento a queste superfici contrastanti come schemi di controllo "diretto" "indiretti" e. Nello schema controllo indiretto, biotina cellule prodotte compete con biotina che è stato coniugato e immobilizzato su una superficie polistirolo da streptavidina siti di legame. Inoltre, la streptavidina è coniugato con perossidasi di rafano (HRP). HRP modifica 3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB), per produrre un segnale ottico, 12 che possono essere monitorato quantificando l'assorbanza spettrale (cioè, densità ottica) a 450 nm (OD 450). Così, il sistema di controllo indiretto consente ai ricercatori di misurare biotina cellule-prodotto dal monitoraggio del attentuation del segnale OD 450.
Lo schema di controllo diretto sfrutta l'evento streptavidina-biotina immobilizzando streptavidina direttamente ad una superficie del materiale e consentendo biotina cellule prodotte e HRP biotinilato a competere per streptavidina siti di legame. Ancora una volta, lalivelli relativi di biotina cellule prodotte sono monitorati misurando un segnale OD 450.
Nel loro insieme, le cellule ingegnerizzate e le superfici funzionalizzate ci permettono di controllare le proprietà di una superficie programmabili inducendo reti nelle cellule viventi. In altre parole, abbiamo creato un sistema che sfrutta l'adattabilità degli organismi viventi e l'affidabilità e la specificazione di un'interfaccia materiale ingegnerizzato collegando questi sistemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato una nuova strategia per l'interfacciamento cellule ingegnerizzate vive con una superficie del materiale funzionalizzato. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una linea cellulare in grado di sintetizzare livelli elevati di biotina quando indotta con IPTG. Gli elevati livelli di biotina possono poi essere utilizzati per modificare la superficie funzionalizzata. I protocolli dettagliati come ingegnere alla linea di cellule di E. coli e come creare due superfici funzionalizzate …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il sostegno di premio FA9550-13-1-0108 dall'Ufficio Air Force di ricerca scientifica degli Stati Uniti. Gli autori inoltre riconoscono il sostegno di premio N00014-15-1-2502 dal Office of Naval Research degli Stati Uniti, il finanziamento dell'Istituto per Critical Tecnologia e Scienza Applicata presso Virginia Polytechnic Institute e State University, e dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, il numero di riconoscimento 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
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