Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen
Summary
Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.
Abstract
De lever speelt een beslissende rol in de regulering van systemische ontsteking. Bij chronische nierziekte in het bijzonder de lever reageert in reactie op de uremische milieu, oxidatieve stress, endotoxemie en verminderde klaring van circulerend proinflammatoire cytokinen door het produceren van een groot aantal acute fase reactanten. Experimentele instrumenten te bestuderen ontsteking en de achterliggende rol van hepatocyten zijn cruciaal voor de regulering en de bijdrage van hepatische cytokinen ze systemisch acute fase respons en langere pro-inflammatoire scenario, vooral in een ingewikkelde omgeving begrijpen zoals chronische nierziekte. Aangezien het bestuderen van complexe mechanismen van een ontsteking in vivo uitdagend blijft, resource-intensieve en meestal vereist het gebruik van transgene dieren, primaire geïsoleerde hepatocyten zorgen voor een robuust hulpmiddel om mechanistische inzicht te krijgen in de lever acutefasereactie. Aangezien dit in vitro techniek beschikt over een matige kosten, hoge reproduceerbaarheid en gemeenschappelijke technische kennis, geïsoleerde primaire hepatocyten kunnen ook gemakkelijk worden gebruikt als een screening aanpak. We beschrijven hier een enzymatische methode gebaseerd op primaire muizen hepatocyten te isoleren en beschrijven we de beoordeling van een ontstekingsreactie in deze cellen middels ELISA en kwantitatieve real-time PCR.
Introduction
Chronische nierziekte (CKD) kan worden gedefinieerd als een toestand van acute en chronische ontsteking 1. Bij patiënten met CKD, serum niveaus van het hormoon phosphaturic fibroblast groeifactor 23 (FGF23) geleidelijk stijgen, om het serum fosfaat homeostase 2 te handhaven. Verhoogde serum niveaus FGF23 onafhankelijk geassocieerd met cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die beginnen hemodialysebehandeling 3, 4. Bovendien hebben verschillende klinische studies aangetoond een sterke correlatie tussen verhoogde niveaus FGF23 en serum niveaus van C-reactief proteïne (CRP), interleukine-6 (IL-6) en tumornecrosefactor α (TNFa) 5, 6. Bovendien is in een experimentele studie werd onlangs aangetoond dat FGF23 direct richten hepatocyten en een ontstekingsreactie door het verhogen CRP en IL-6 p veroorzakenroduction in de lever 7. Daarom FGF23 kan fungeren als een circulerende factor die bijdraagt aan systemische ontsteking in CKD.
In de vroege jaren '70, de primaire hepatocyten werden geïsoleerd en bestudeerd voor de eerste keer 8. Sindsdien primair gekweekte levercellen zijn uitgebreid gebruikt metabolische verwerking, hormonale functie, metabolisme en toxiciteit en immuniteit en ontstekingsreacties 9 onderzoeken 10. Vorige protocollen zijn voornamelijk de enzymatische isolatie van primaire hepatocyten uit menselijk leverweefsel 11, 12. Terwijl een uitstekend model, laat dit uit de mogelijkheid om te onderzoeken hoe genetische manipulatie beïnvloedt complex lever signalering mechanismen evenals functionele gevolgen op verschillende soorten stimuli. Hieronder beschrijven we de isolatie van muizen hepatocyten. Met name kan het effect van verschillende mediatoren van de hepatische acute fase respons, zoals lipopolysaccharide (LPS), IL-6 en FGF23 worden geanalyseerd op een gemakkelijke, snelle en reproduceerbare wijze 13.
Hierin presenteren we een protocol voor de enzymatische isolatie van hepatocyten van volwassen muizen, en we tonen aan dat vastgesteld inductoren van ontsteking, zoals LPS en IL-6, alsook nieuwe ontstekingsmediatoren zoals FGF23 rechtstreeks expressie en uitscheiding van kunnen stimuleren inflammatoire cytokines, zoals CRP en IL-6 in gekweekte hepatocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het isoleren van primaire hepatocyten van muizen is een snel, goedkoop en betrouwbaar hulpmiddel om ontstekingsreacties ex vivo te bestuderen. Indien correct uitgevoerd, kunnen de resultaten eenvoudig worden gegenereerd en gereproduceerd op een tijdige en kostenefficiënte manier. De volgende punten moet zorgvuldig worden beoordeeld met het oog op een succesvolle isolatie te waarborgen.
De chirurgische incisie en de canule van het IVC moet worden uitgevoerd onder algemene verdoving …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH (R01HL128714 CF) en (F31DK10236101 KS) en de American Heart Association (CF AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
