Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon
Summary
Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.
Abstract
Karaciğer sistemik inflamasyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Özellikle kronik böbrek hastalığı, karaciğer Üremik ortamda, oksidatif stres, endotoksemi ve akut faz reaktanları çok sayıda üreterek proinflamatuar sitokinler dolaşımdaki azalmış temizlenmesi cevaben tepki verir. inflamasyon ve hepatositlerin yatan rolü deneysel araçları incelemek için kronik böbrek hastalığı gibi özellikle karmaşık bir ortamda düzenlenmesi ve karaciğer sitokinlerin katkısı sistemik akut faz yanıtı ve uzun bir pro-enflamatuar senaryo, anlamak için çok önemlidir. In vivo enflamasyon karmaşık mekanizmalar okuyan zorlu kaldığından, kaynak-yoğun genellikle ve transgenik hayvanların kullanımını gerektirir, birincil izole hepatositler hepatik akut faz yanıtı içine mekanistik anlayışlar kazanmak için sağlam bir araç sağlar. Bu in vitro tekniği ılımlı maliyetleri özellikleri olduğundan, yüksek yenidenüretilebilirlik ve ortak teknik bilgi, birincil izole hepatositler de kolayca bir tarama yaklaşımı olarak kullanılabilir. Burada, birincil fare hepatositleri izole etmek için bir enzimatik temelli bir yöntem tarif ve biz ELISA ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak bu hücrelerin bir inflamatuar yanıtın değerlendirilmesi açıklar.
Introduction
Kronik böbrek hastalığı (CKD), akut ve kronik iltihap 1 bir durum olarak tanımlanabilir. KBH olan hastalarda, phosphaturic hormon fibroblast büyüme faktörü 23 (FGF23) serum düzeyleri giderek serum fosfat homeostazisini 2 korumak için yükselir. Artmış serum FGF23 düzeyleri bağımsız hemodiyaliz tedavisi 3, 4 başlıyor hastalarda kardiyovasküler morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Bundan başka, pek çok klinik çalışmalar, yüksek FGF23 seviyeleri ve C-reaktif protein (CRP), Interlökin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü a (TNFa), 5, 6 serum seviyeleri arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Ayrıca, deneysel bir çalışmada, son zamanlarda FGF23 doğrudan hepatositler hedef ve artan CRP ve IL-6 p bir inflamatuar yanıta neden olduğunu göstermiştirkaraciğer 7 roduction. Bu nedenle, FGF23 CKD sistemik inflamasyona katkıda bulunan dolaşan bir faktör olarak hareket olabilir.
70 yılların başında, birincil hepatositler izole edildi ve ilk kez 8 okudu. O zamandan beri primer kulturlenmiş hepatik hücreler yoğun, 10 metabolik işlem, hormonal fonksiyon, ilaç metabolizması ve toksisitesinin yanı sıra bağışıklık yanıtlarını ve enflamatuar yanıtları 9 incelemek için kullanılmıştır. Önceki protokoller esas insan karaciğer dokusunda 11, 12 birincil hepatositlerin enzimatik izolasyonuna tarif etmişlerdir. mükemmel bir model olsa da, bu karmaşık karaciğer sinyal mekanizmalarını yanı sıra uyaranların farklı türde üzerine fonksiyonel sonuçlarını nasıl etkilediğini genetik manipülasyon çalışma olanağı dışarıda bırakır. Aşağıda, fare primer hepatositlerinde izolasyonunu tarif. Özellikle, böyle bir lipopolisakarit (LPS), IL-6 ve FGF23 hepatik akut faz tepkisinin birçok aracıların, etkisi, kolay, hızlı ve yeniden üretilebilir bir şekilde 13 analiz edilebilir.
Burada, erişkin farelerden hepatositlerin enzimatik izolasyonu için protokol mevcut, ve LPS ve IL-6, hem de böyle bir FGF23 gibi yeni enflamasyon ile ilgili aracıların enflamasyon kurulan indükleyicileri, doğrudan ifadesini ve ifrazatını uyardığını göstermektedir bu tür kültürlenmiş hepatositlerde CRP ve IL-6 gibi enflamatuar sitokinleri,.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farelerden alınan birincil hepatositler yalıtma inflamatuar yanıtları ex vivo çalışma için hızlı, ucuz ve güvenilir bir araçtır. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, sonuçlar kolaylıkla üretilir ve zamanında ve maliyet-etkin bir şekilde çoğaltılabilir. Aşağıdaki hususlar, dikkatli bir şekilde, başarılı bir izolasyon sağlamak amacıyla değerlendirilmelidir.
Cerrahi kesi ve IVC kanülasyon genel anestezi altında ve ötenazi sonra ya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (R01HL128714 CF) ve (KS F31DK10236101) ve Amerikan Kalp Derneği (CF ve AG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
