Summary
En fremgangsmåde til stabilisering og adskillelse native proteinkomplekser fra umodificeret væv lysat anvendelse af en amin-reaktivt protein tværbindingsmiddel koblet til en hidtil ukendt todimensional polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) system er vist.
Abstract
Der er mange veludviklede metoder til oprensning og studere enkelte proteiner og peptider. Men de fleste cellulære funktioner udføres af netværk af interagerende protein-komplekser, som ofte er vanskeligt at efterforske fordi deres binding er ikke-kovalent og let forstyrres af oprensningsteknikker. Dette arbejde beskriver en fremgangsmåde til stabilisering og adskillelse native proteinkomplekser fra umodificeret væv under anvendelse af todimensional polyacrylamidgelelektroforese. Tissue lysat påsat en ikke-denaturerende blå-nativ polyacrylamidgel, derefter en elektrisk strøm anvendes indtil proteinet migrerer en kort afstand ind i gelen. Gelen strimmel indeholdende det migrerede protein derpå udskåret og inkuberet med aminreaktive krydsbindingsreagens dithiobis (succinimidylpropionat), som covalent stabiliserer proteinkomplekser. Gelen strimmel indeholdende tværbundne komplekser derefter støbt i en natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel, og than komplekser adskilles fuldstændigt. Metoden bygger på teknikker og materialer er velkendte for de fleste molekylærbiologer, hvilket betyder at det er billigt og nemt at lære. Selv om det er begrænset i sin evne til i tilstrækkelig grad at adskille ekstremt store komplekser, og har ikke været universelt succes, metoden var i stand til at fange et bredt udvalg af velundersøgte komplekser, og er sandsynligvis gældende for mange systemer af interesse.
Introduction
Normal cellulær funktion er afhængig af protein-protein interaktioner 1 , 2 . Som følge heraf er menneskelige sygdomme ofte præget af forstyrrelser i samlingen og opførelsen af forskellige proteinkomplekser 3 . Evnen til at karakterisere sådanne interaktioner er derfor kritisk. Nuværende midler til at detektere disse interaktioner kræver rensning af målproteiner, ofte efterfulgt af nedtrængning af deres samspillende partnere. Konventionel oprensning udføres ved differentiel centrifugering, udfældning og / eller kromatografi 4 . Disse metoder er tidskrævende, skal ændres for hvert målprotein og resulterer ofte i lave udbytter. Moderne oprensningsmetoder involverer fusion af peptidmærker til målretning af proteiner efterfulgt af immunpræcipitation eller ekstraktion på søjler, der er fyldt med perler bundet til et fangsmolekyle 5 ,"> 6. Mens dette er strækbart for mange proteiner, kræver sekvens modifikation af målet, hvilket potentielt kan medføre konstruktioner, der afviger i affinitet for deres sædvanlige bindingspartnere. Den fine karakter af nogle protein-protein interaktioner betyder denne metode ikke kan anvendes til mange scenarier. Derudover pull-down assays anvendes til at kortlægge protein-protein-interaktioner kan ikke fange et nøjagtigt cellulær billede, på grund af begrænsede frihedsgrader og ikke-native niveauer af bait-proteinet.
Ideelt set kunne proteinkomplekser påvises i deres native tilstande, uden behov for oprensning eller pull-down. Blå nativ polyacrylamidgelelektroforese (BN-PAGE) blev udviklet som en mindre-denaturerende alternativ til natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og giver mulighed for adskillelse af visse proteiner og komplekser fra biologiske prøver 7. Imidlertid proteiner i BN-PAGE adskille baseret på en large antal variabler, herunder størrelse, ladning, tredimensionelle struktur, og association med andre molekyler. Interaktionerne af disse faktorer resulterer ofte i co-separation af proteiner, aggregatdannelse og dårlig proteinbånd opløsning. Todimensional nativ polyacrylamidgelelektroforese løser nogle, men ikke alle, af disse problemer 8.
At omgå de komplikationer forbundet med nativt separation, nogle forfattere anvender aminreaktive krydsbindingsreagenser, såsom dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), at indfange proteinkomplekser i vævslysater 4. Disse behandlede lysater kan derefter denatureres og adskilles ved SDS-PAGE, og samtidig bevare den native størrelse og makeup af proteinkomplekser. Men da krydsbindingsreagenser reagere ud fra nærhed af et molekyle til et andet, og proteiner i vævslysater har mange frihedsgrader og kan stokastisk interagere, specifik baggrund cross-linking kan være høj, især i koncentrerede prøver. Dette kan føre til svære at fortolke resultater.
Her demonstrerer vi brugen af en hybrid BN-PAGE / SDS-PAGE-metode, betegnet multimer-polyacrylamidgelelektroforese (multimer-PAGE) for at adskille og detektere proteinkonstruktioner i komplekse blandinger. I første omgang suspenderes cellelysat i polyacrylamidgel via BN-PAGE. Den lysatholdige gel omsættes derefter med tværbindingsreagens DSP. Pseudo-immobiliseret og lidt adskilt på gelen, er proteiner meget mindre tilbøjelige til at reagere uspecifikt, hvilket betyder, at baggrunds-tværbindingsreaktiviteten reduceres. Efter tværbinding udskilles gelbåndene og adskilles via SDS-PAGE. Den resulterende gel kan derefter analyseres på ethvert middel, der typisk er forbundet med polyacrylamidgelelektroforese. Denne metode muliggør adskillelse og påvisning af native proteinkomplekser i umodificeret vævsl lysat uden behov for yderligere rensning eller pull-down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vævspræparation
- Forbered 10 ml 4x BN-PAGE-prøvepuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% vægt / volumen glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
BEMÆRK: Denne stamopløsning kan fremstilles i forvejen og opbevares ved 4 ° C. - Fortynd 250 pi 4x prøvepuffer i 750 pi dH2O indeholdende 1 X kommerciel protease inhibitor cocktail. Vortex og chill på is.
- Homogenisere 20 mg målvævet i 1 mL 1x iskold BN-PAGE-prøvepuffer med 30 slag af en ren dounce homogenisator.
BEMÆRK: For denne demonstration eksperiment, målvævet er hele rotte hjernevæv. Efter homogenisering kan prøver behandles med mild detergent, såsom 2% digitonin til at opløseliggøre og tillade elektroforese af membranproteiner. - Overfør homogenatet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der centrifugeres ved 14.000 xg i 30 minutter til pelletering af uopløselige cellulære indhold. after centrifugering, dekanter supernatanten til et rent rør på is.
- Følg producentens instruktioner for at måle supernatant proteinkoncentration ved anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) eller lignende proteinkvantificering assay.
- Hvis homogenatet prøve (r) indeholder detergent tilsættes en mængde på 5% Coomassie Blue G-250 i vandig opløsning er tilstrækkelig til at bringe homogenatet opløsning til 0,25% Coomassie.
2. BN-PAGE
- Fortynd 25 ml 20x blå native (BN) elektroforese buffer lager (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricin, pH 6,8) i 475 ml dH2O indeholdende 0,002% Coomassie Blue for at gøre 500 ml 1x løbebuffer.
- Hvis prøverne indeholder detergent, stedet gøre 250 ml 1x løbebuffer indeholdende 0,02% Coomassie og yderligere 250 ml indeholder ingen.
- Chill buffer (e) til 4 ° C.
- Rengøre og samle en polyacrylamidgel hælde kassette overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Efter gelerne har polymeriseret, skylles kassetten med dH2O og samle elektroforeseapparatet overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Fjern brønd kam og fyld brøndene med 1x BN-PAGE løbebuffer. Undgå at fylde hele den indvendige kammer med buffer, indtil prøverne er indlæst.
- Hvis prøverne indeholder detergent, fylde brøndene med bufferen indeholdende 0,02% Coomassie Blue.
BEMÆRK: Udfør trin 2,7-2,9 ved 4 ° C.
- Hvis prøverne indeholder detergent, fylde brøndene med bufferen indeholdende 0,02% Coomassie Blue.
- Anvendelse gelladningsspidser, afpipetteres en volumen af homogenat indeholdende 20 ug protein i de ønskede brønde. Pipette et ækvivalent volumen af 1x BN-PAGE-prøvepuffer i ubrugte brønde.
BEMÆRK: Brug proteinkoncentrationen bestemmes ud fra BCA-analyse for at beregne det passende volumen af homogenat for at tilføje tilBrøndene. - Når prøverne er fyldt, skal du fylde det indre kammer med 1x BN-PAGE kørerbuffer. Sørg for, at gelen er helt nedsænket i buffer. Fyld derefter det ydre kammer med 1x kørerbuffer til det niveau, der er angivet af producenten.
- Hvis prøver indeholder vaskemiddel, skal du fylde det indre kammer med 1x bufferen indeholdende 0,02% Coomassie Blue, og det ydre kammer med farvefrit 1x løbebuffer.
- Tilslut elektroderne til strømforsyningen og elektroforese proteinerne i gelen ved 150 V indtil farvestoffet udvikler sig ~ 2 cm i opløsende lag. Stop og afbryd strømforsyningen.
3. tværbinding
BEMÆRK: Udfør trin 3.1-3.6 ved 4 ° C.
- Demonter elektroforeseapparatet og adskilles glaskassettens ruder. Fjern og kassér stablingslaget.
- Skær forsigtigt gelen lige under bundkanten af farvestoffronten. Tagepleje at gøre denne nedskæring som glat og lige som muligt, og derefter kassere den ubrugte stykke gel. Dette vil efterlade et ~ 2 cm brede, horisontale stribe af polyacrylamidgel, der vil indeholde alle proteinet i homogenatet prøven.
- Fraklippe ubrugte dele langs kanterne af gelstrimmel.
- Læg forsigtigt strimlen i 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS) i en lille beholder, og bland forsigtigt ved nutationen i 30 minutter til ækvilibrering.
- Efter ækvilibrering kassere og erstatte PBS med yderligere 10 ml. Pipetter 500 pi 25 mM DSP opløst i dimethylsulfoxid i PBS og fortsæt opblanding som ovenfor (trin 3.4) i 30 minutter.
- Hæld DSP opløsning. Tilføje 10 ml 0,375 M tris (hydroxymethyl) aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCI), pH 8,8, indeholdende 2% natriumdodecylsulfat (SDS) til standsning af uomsat DSP. Fortsæt nutationen i 15 min.
4. SDS-PAGE
- Mens gelstrimlen er bratkøling, forberede SDS-PAGE gelopløsninger ifølge standardmetoder 9. Tilsæt ikke polymerisering reagenser.
- Efter standsning, returnere ΒΝ gelstrimmel til stuetemperatur og kaste strimlen ind i en ny gelkassette.
- For at gøre dette, omhyggeligt afhente gelen og placere den på en ren gelkassette afstandsplade.
- Orient strimlen, så bunden af farvestoffet front er nærmest toppen af ny kassette (dvs. den side, der rejste længst løbet BN-PAGE bør nærmest toppen af den nye kassette, gelen strimmel bør vendes fra dens forudgående orientering). Se figur 3.
- Placer strimlen således, at dens øverste kant ligger selv med hvor den øverste kant af dækpladen bliver (dvs. vil det være på toppen af den nye gel). Sørg for, at farvestoffet foran er parallel med de vandrette kanter af glaspladen.
- Skubbe den ene side af det udskårne bånd mod en af afstandselementerne vægge, efterlader plads på than anden side til gel skal hældes og et protein standard eller stigen, der skal lastes.
- Hvis den nederste kant af gelen strimmel indeholder nogen hakkede eller ujævne områder, forsigtigt skære dem væk. Hvis tilstede, vil de trap bobler under gel hælde.
- Når gelen strimmel er placeret korrekt, lå dækpladen over afstandsplade. Tryk forsigtigt at skubbe ud eventuelle luftbobler.
- Fortsæt med at samle gel istøbningsapparatur overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Tilføj polymerisations- reagenser til adskillelsesgelen buffer, og hæld det i den forberedte gelkassetten anvendelse af en serologisk pipette. Fyld gelkassetten til ~ 2 cm under det udskårne BN-PAGE-gel strimmel, at give plads til stabling lag.
- Tilsæt 100 pi butanol over toppen af den hældt gel, og tillade 30 minutter til polymerisation af den opløsende lag. Hæld butanol.
- Tilføj polymerisations- reagenser til stabelgelen opløsning. Ved hjælp af en serological pipette, hæld stabling lag for at fylde alle resterende tomme plads i gelen kassette.
- Vip gelkassetten som stablingen lag hældes så det fylder rummet under gelstrimmel, og ikke kommer i klemme luftbobler.
- Som stabelgelen buffer udfylder det tomme rum under gelstrimmel, gradvist tilbage gelkassetten til niveau fod.
- Fortsætter med at fylde det tomme rum ved siden af den udskårne gel strimmel med stabelgelen puffer, indtil det næsten overflow.
- Tillade stabling lag til at polymerisere i 30 minutter.
BEMÆRK: 10x SDS-PAGE løbebuffer (250 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan (tris), 1,9 M glycin, 1% SDS), mens gelen polymerisere. Dette kan også gøres på forhånd og opbevares ved stuetemperatur. - Fortynd 50 ml 10X SDS-PAGE løbebuffer lager i 450 ml dH2O at gøre 1x arbejdspuffer.
- Efter stablingen lag er polymeriseret, fjernes gelkassetten fra hældeapparat, skyl med dH2O og samle elektroforeseapparatet overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Fyld det indre kammer helt med 1x SDS-PAGE kørende puffer, derefter fylde det ydre kammer til det niveau af fabrikanten.
- Indlæse plads ved siden af den udskårne gel strimmel med en molekylvægt stige eller passende proteinstandard.
- Fastgør elektroderne til strømforsyningen, og elektroforese prøverne ved 120 V. Når Coomassie farvestof løber ud af gelen, stop og afbryde strømforsyningen.
- Analyser gelen under anvendelse af standard fremgangsmåder til elektroblotting og protein detektering ved antistofbinding 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne demonstration eksperiment blev multimer-PAGE udført på hele rottehjerner lysat. De resulterende separerede proteiner blev blottet på polyvinyliden diflouride (PVDF) membraner, og derefter probet med antistoffer mod proteiner, der vides at danne komplekser. Figur 1 viser en validering af protokollen på to måder. Første viser vi, at de tværbundne proteiner er spaltelige ved tilsætning af et reduktionsmiddel, hvilket betyder de observerede højere molekylvægt dannes ved krydsbindingsreagens, og ikke skyldes nogen anden bestanddel af protokollen (figur 1A) . Sekund, viser vi, at tværbinding er følsom for tilsætning af detergenter (figur 1B), hvilket betyder tværbindingen er specifik for kompleksbundne proteiner og at tilfældig reaktivitet grundet tæt nærhed på gelen minimeres. Figur 2 viser, at fremgangsmåden ikke fanger respiratory kompleks II, men ellers har bred anvendelighed til indfangning både opløselige og membranbundne komplekser.
Figur 1: Validering af multimer-PAGE metode. (A) Capture af proteinkomplekser ved in-gel tværbinding med DSP er følsom for spaltning med dithiothretol (DTT). Multimer-PAGE blev udført på hele rottehjerne lysat uden (A1) eller med (A2) 5 mM dithiothretol inkluderet i Tris / SDS quenching opløsning. Gelen blev elektroblottet på PVDF-membraner, og derefter probet for kinesin tunge kæde. En høj molekylvægt bånd observeret på begge membraner, sandsynligvis svarende til alle eller en del af kinesin motor proteinkompleks. Der er et yderligere bånd forekommer ved 126 kDa på DTT-behandlede blot, molekylmassen af kinesin tunge kæde peptid. Dithiothreitol er et reduktionsmiddel, og er i stand til at vende cross-linking ved at spalte disulfidbindingen til stede i DSP. Den kinesin aggregat er derfor følsom for spaltning med DTT. (B) Protein kompleks fange er følsom over for tilsætning af denaturering rengøringsmidler. Multimer-PAGE blev udført på hele rottehjerner lysat som beskrevet i teksten, bortset stigende mængder (0 til 2%) af SDS (venstre) eller Triton X-100 (til højre) blev tilsat til lysatprøver og derefter inkuberet på is i 30 min før indlæsningen første gel. De endelige geler blev blottet på PVDF-membraner og probet for α-synuclein. Mindst tre bånd af stigende molekylvægt observeres, svarende til a-synuclein monomer, tetramer, og octamer hhv. Signalintensiteterne af de oligomere bands aftager med koncentration stigende detergent, hvilket indikerer, at tværbinding virkningsfuldhed er afhængig af nativt protein konformation. Klik her til view en større version af dette tal.
Figur 2: Påvisning af indfangning af protein-komplekser under anvendelse multimer-PAGE. (A) Opløselige og membranbundne proteinkomplekser blev erobret fra (A) hel rottehjerne lysat eller (B) lysat inkuberet med 2% digitonin i 1 time ved 4 ° C, ved at udføre multimer-PAGE som beskrevet i teksten. Gelerne blev derefter blottet og PVDF membranerne probet for komponenter af forskellige komplekser. Høj molekylvægt observeres på membranen probet for acetyleret tubulin, som er kendt for at stabilisere mikrotubuli. Dynein og kinesin er multi-subunit motor proteinkomplekser med molekylvægte på 1,5 MDa og 380 kDa. Membranerne blottet for komponenter af disse komplekser viser høj-molekylvægt. Desuden multimer-PAGE held captured den HSP90 dimer. a-synuclein danner tetramerer og octamerer samt neurotoksiske højmolekylære oligomerer. Octameren og en stribe af højere vægt arter ses på det blottede membran. VDAC dimerisering er også observeret. detekteres høj molekylvægt på membranerne blottet for komponenter af mitokondrielle komplekser I og IV. Men membranen blottet for SDHA, et medlem af kompleks II, ikke viser nogen passende høj molekylvægt bånd. AcetTUB: acetyleret α-tubulin; βTUB: β-tubulin; Dynein: dynein tung kæde; HSP90: varmechokprotein 90; Kinesin: kinesin tung kæde; NDUFS3: jern-svovl center 3 af mitokondriel kompleks I; VDAC: porin; SDHA: succinatdehydrogenase af mitokondriel kompleks II; COXIV: cytochrom C-oxidase af mitokondrie kompleks IV. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generel multimer-PAGE flowchart. (A) Forbered væv lysat under anvendelse af ikke-denaturerende metoder, såsom homogenisering i BN-PAGE-prøvepuffer. (B) afpipetteres lysat i BN-PAGE-gel, derefter udføre elektroforese (150 volt) i BN-PAGE løbebuffer. Tillad prøven at migrere indtil farvefronten har migreret ~ 2 cm ind i adskillelsesgelen. (C) Slet stabling lag og ubrugte del af den opløsende lag. (D) Gelen nedsænkes strimmel i PBS, og ligevægt med rystning i 30 minutter. (E) Fjern PBS, og re-nedsænkes gelen strimmel i PBS indeholdende 2,5 mM DSP. Ryst i 30 min. (F) Slet DSP opløsning, derefter igen nedsænkes gelen strimmel i 375 mM Tris indeholdende 2% SDS og rystes i 30 minutter. Komplekser er til stede i gelen strimmel nu er stabile ved cross-linking. (G) Drej gelstrimmel 180 ° og støbt i en ny SDS-PAGE gel. Medtag både stabling og løse lag. (H) Løs prøven ved elektroforese (120 volt). (I) Slet gelstrimmel og stabling lag, derefter analysere løse lag efter behov. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein interaktioner er vigtige for enhver opgave levende ting udfører. På grund af dette, de er genstand for en intens undersøgelse og forskning. Multimer-PAGE er en ny fremgangsmåde til indfangning, separering og analyse af en lang række af proteinkomplekser. Vi har tidligere vist sin anvendelighed til at studere oligimerization af den sygdomsassocierede protein α-synuclein 11. Det er dog udvides til mange proteinkomplekser, som vist i figur 2. Sammenlignet med andre fremgangsmåder til at studere protein-komplekser, multimer-PAGE er fordelagtig på grund af sin enkelhed og kortfattethed. Tiden fra vævsprøve til fuldstændig adskilt SDS-gel er ca. 8 timer. Fra detektering kan ske ved typisk western blot, kan protokollen udføres på umodificeret væv lysat, med detektionsgrænser meget lavere end dem forbundet med pull-down eksperimenter. Derudover mest veludstyrede molekylærbiologi laboratories vil være i stand til at udføre teknikken med lidt forudgående investeringer. Som diskuteret senere, mest af udfordringen forbundet med multimer-PAGE leveres med fejlfinding og optimering af fremgangsmåden for hvert protein-kompleks undersøgt.
Mens multimer-side skal være tilgængelige for de fleste molekylærbiologer, dens succes er afhængig af forskerens dygtighed og erfaring. Kritisk skal opskæring og re-støbning af BN gel strimlen i den nye SDS-gel gøres med omhu. Det er vigtigt at orientere gelstrimmel så elektroforese forårsager proteiner til at migrere ind i SDS-gel i parallelle bånd. Hvis gelstrimlen støbes skævt, vil proteinbåndene migrere ind i hinanden og data går tabt. Især for store komplekser, dreje gelstrimmel før støbning den i SDS-PAGE-gel er ligeledes vigtig. Dette giver større komplekser, som måske ikke er migreret meget langt ind i BN-PAGE-gel, mere tid til at blive trukket ind i løse layer af SDS-PAGE-gel. Vigtigere, bør også betragtes ændringerne af protein størrelse og fysiske egenskaber forårsaget af krydsbinding under analyse. For eksempel har nogle proteiner med lav molekylvægt, såsom α-synuclein, er ikke godt tilbageholdt på PVDF-membraner, men deres tværbundne oligomerer er 12. Dette kan forvirre sammenlignende analyse, og der skal tages hensyn til.
Ved adskillelse af et kompleks af multimer-PAGE for første gang, er det vigtigt at validere fremgangsmåden. Vi foreslår tre validering / fejlfinding tests. Først, at peptidet af interesse migrerer ind i BN gel ved at følge multimer-PAGE protokol indtil udskæring af gelen strimmel, så stop, duppes strimlen på PVDF-membran, og sonde for underenheden af interesse. Hvis der ikke er noget signal, komplekset sandsynligvis ikke migrere ind i BN gel, hvilket betyder at det skal gøres mere porøs, eller prøven bør kunne migrere længere ind i resolving lag. Tilstedeværelsen af et signal bekræfter, at mindst ubundet underenhed migreret ind i gelen. På dette stadium, vil det være vanskeligt at bekræfte tilstedeværelsen af den fulde kompleks. Hvis der detekteres bevis for underenheden i BN gelstrimmel, gå videre til den anden test. Udføre multimer-PAGE uden en tværbindende trin, derefter duppes over på PVDF-membran og probe til underenheden. Underenheden bør denaturere i nærvær af SDS og migrerer normalt i SDS-gelen. Hvis dette ikke sker, er der sandsynligvis nogle problemer med forskerens teknik. BN gelstrimlen kan have været dårligt skåret, forlader nogle protein bag, eller SDS-gelen kan være blevet støbt forkert. Endelig udføre multimer-PAGE med en inkluderet tværbinder spaltningstrin, derefter duppes og sonde, som diskuteret i figur 1. Dette bekræfter aggregering af komplekset skyldes tilsætning af DSP, og ikke en uventet konsekvens af en anden del af multimeren-PAGE protokol. Spaltningen bør resultere i en reduktiond intensitet samlede bånd og en forøget intensitet subunit monomer bånd ved billeddannelse. Hvis der ikke samlede bånd ses fra normal multimer-PAGE, men monomer- band stigninger i intensitet, når DSP spaltes, har komplekset sandsynligvis gjort det til SDS-gel, men undlod at vandre ind i løse lag.
I sin nuværende tilstand, multimer-PAGE kan anvendes til mange proteinkomplekser, men er ikke en one-size-fits-all protokol. Der er behov sandsynligvis vil blive ændret til hver kompleks af interesse. Et almindeligt problem er vist i figur 2: tilfangetagne komplekser er ofte så store, at de næppe migrerer på SDS-PAGE. Dette kan håndteres ved at ændre porøsiteten af SDS-gelen eller ved at udføre elektroforese i længere tid. En yderligere komplikation er den lejlighedsvise forekomst af mere end to bånd på gelen. Ufuldstændig reaktion med tværbinderen kan resultere i en fordeling af mellemliggende molekylvægt bånd 13. Dette kan gøre det difskeligt at afgøre, om multiple bånd er repræsentative for fysiologisk vigtige oligomere mellemprodukter eller simpelthen utilsigtede konsekvenser af partiel tværbinding. For membranproteiner, der skal solubiliseres før analyse, er det også vigtigt at vurdere den virkning, at valget af detergent på adfærd af proteinkomplekser. Den anvendte detergent til opløseliggørelse membranproteiner påvirker deres konformationer, sammenslutninger med bindingspartnere, og funktioner 14, 15. Detergent choice påvirker også effekten af krydsbinding 16. Det er således sandsynligt, at de ideelle opløseliggørende betingelser vil variere med komplekset blev undersøgt.
Multimer-PAGE lejlighedsvis ikke fanger et kompleks, som er vist på den SDHA blottet i figur 2. succinatdehydrogenase er en del af 124 kDa mitokondrie Complex II, som er lille nok, at det skal bevæge sig let ind i gelen.At det ikke blev registreret indikerer, at multimer-PAGE var ude af stand til at fange den. Tilfælde som disse har mange mulige forklaringer. De fleste tværbindingsreagenser indeholder to reaktive ender, der danner kovalente bindinger med aminosyresidekæder. Den effektivitet, hvormed tværbindingsreagenser capture proteinkomplekser er afhængig af deres tilgængelighed til reaktive rester. I tilfældet med DSP, tværbinding opnås ved acylering af opløsningsmiddel-eksponerede primære og sekundære alifatiske aminogrupper, sædvanligvis de e-aminogrupperne i lysin 17. Lysinrester findes normalt på proteinet overflade, men deres lejlighedsvis optaget i hydrofobe centre nedsætter effektiviteten af tværbinding 13. Underenhederne af kompleks II er begravet i den mitokondriske membran, og kan forblive utilgængelige for DSP, selv efter solubilisering med digitonin 18. Meget store og tæt-pakning komplekser, såsom amyloid oligomers, kan også begrænse tilgængeligheden af overflade lysinrester til krydsbindingsreagenser. Som et resultat heraf kan disse typer af proteinkonstruktioner ikke kompatible med multimer-PAGE. Det er også muligt at Coomassie Blue, som binder til hydrofobe områder og kationiske rester, dvæler efter ækvilibrering i PBS og blokerer tværbinding i nogle tilfælde 19. Dette kan mindske eller eliminere detektion af berørte oligomerer af multimer-PAGE. Fremgangsmåden er ikke en universel assay til karakterisering alle proteinassociationer, og bør ikke betragtes hvor kvantificering i ønsket. Imidlertid multimer-PAGE er en billig, relativt hurtig værktøj til analyse proteinkomplekser, og kan betragtes sammen med anden eksisterende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støttet af NIH / Nida DA034783. Vi takker Bryan A. Killinger til teknisk bistand med multimer-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
