Summary
Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.
Abstract
Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.
Introduction
Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein - Wechselwirkungen 1, 2. Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe 3 markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie 4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid - Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang - Moleküle gebunden 5 geladen wird ,„> 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein - Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins.
Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid - Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben 7. Eine getrennte Proteine in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme 8.
Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten 4 zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu.
Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gewebepräparation
- Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann. - Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 & mgr; l dH 2 O , enthaltend 1x kommerziellen Protease - Inhibitor - Cocktail. Vortex und Chill auf Eis.
- Homogenisiert 20 mg des Zielgewebes in den 1 ml 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffern mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators sauber.
HINWEIS: Für dieses Demonstrationsexperiment, das Zielgewebe ganze Rattenhirngewebe. Nach der Homogenisierung Proben werden mit einem milden Reinigungsmittel, wie beispielsweise 2% Digitonin zu solubilisieren und erlauben Elektrophorese von Membranproteinen behandelt. - Überträgt das Homogenisat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert bei 14.000 xg für 30 min unlöslichen Zellinhalt zu pelletieren. after Zentrifugieren dekantiert den Überstand in ein sauberes Röhrchen auf Eis.
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers überstehende Flüssigkeit Proteinkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) oder ähnlichen Proteinquantifizierung Assay zu messen.
- Wenn das Homogenat Probe (n) Reinigungsmittel enthält, eine Menge von 5% Coomassie Blue G-250 in wässriger Lösung hinzu ausreichen, um die Lösung Homogenat Coomassie bis 0,25% zu bringen.
2. BN-PAGE
- Verdünne 25 ml 20x blau nativen (BN) Elektrophoresepuffer Lager (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M Tricin, pH 6,8) in 475 ml dH 2 O 0,002% Coomassie - Blau , das 500 ml 1x Laufpuffer zu machen.
- Wenn Proben Reinigungsmittel enthalten, stellen stattdessen 250 ml 1x Laufpuffer, enthaltend 0,02% Coomassie und weitere 250 ml enthielt keine.
- Chill-Puffer (n) auf 4 ° C.
- Reinigen und montieren ein Polyacrylamidgel Ausgießen Kassette nach Herstelleranweisungen.
- Nachdem die Gele polymerisiert haben, spülen Sie die Elektrophoresevorrichtung gemäß Herstelleranweisungen , um die Kassette mit dH 2 O und zusammenzubauen.
- Entfernen Sie die gut Kamm und füllen die Vertiefungen mit 1x BN-PAGE - Laufpuffer. Vermeiden die gesamte Innenkammer mit Puffer füllt , bis Proben geladen werden.
- Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen die Vertiefungen mit dem Puffer 0,02% Coomassie-Blau enthält.
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2,7-2,9 bei 4 ° C.
- Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen die Vertiefungen mit dem Puffer 0,02% Coomassie-Blau enthält.
- Verwendung von Gel-Ladespitzen, eine Pipette mit einem Volumen von Homogenisats, das 20 ug Protein in die gewünschten Vertiefungen. Pipette ein äquivalentes Volumen von 1x BN-PAGE-Probenpuffer, in einem nicht genutzten Vertiefungen.
HINWEIS: Die Proteinkonzentration aus dem BCA-Test bestimmt das geeignete Volumen des Homogenats berechnen hinzuzufügenDie Brunnen. - Nachdem die Proben geladen sind, füllen Sie die innere Kammer mit 1x BN-PAGE-Laufpuffer. Seien Sie sicher, dass das Gel vollständig in Puffer untergetaucht ist. Als nächstes füllen Sie die Außenkammer mit 1x Laufpuffer auf das vom Hersteller angegebene Niveau.
- Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen Sie die innere Kammer mit dem 1x Puffer, der 0,02% Coomassie Blue enthält, und die äußere Kammer mit farbstofffreiem 1x Laufpuffer.
- Verbinden Sie die Elektroden mit der Stromversorgung und elektrophorieren Sie die Proteine im Gel bei 150 V, bis das Farbstoffband ~ 2 cm in die Auflösungsschicht fortschreitet. Stoppen und trennen Sie die Stromversorgung.
3. Vernetzung
HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.6 bei 4 ° C durchführen.
- Demontieren Sie den Elektrophoreseapparat und trennen Sie die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht.
- Sorgfältig das Gel kurz unterhalb der Unterkante der Farbstofffront schneiden. NehmenPflege dieses Schnitt so glatt und gerade wie möglich zu machen, und dann die nicht verwendete Gelstück verwerfen. Dies wird einen ~ 2 cm breite, horizontale Streifen aus Polyacrylamidgel, läßt die alle das Protein in der Probe Homogenat enthalten.
- Wegschneiden alle nicht verwendeten Teile entlang der Kanten des Gelstreifens.
- Legen Sie das Band in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem kleinen Behälter, und sanft durch Nutation mischte für 30 Minuten äquilibrieren.
- Nach der Äquilibrierung verwerfen und das PBS mit weiteren 10 mL ersetzen. Pipette 500 ul 25 mM DSP in Dimethylsulfoxid in das PBS gelöst und weiter wie oben (Schritt 3.4) für 30 min gemischt wurde.
- Gießen Sie die DSP-Lösung ab. 10 ml 0,375 M Tris (hydroxymethyl) aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), pH 8,8, enthaltend 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), um das nicht umgesetzte DSP quenchen. Weiter Nutation für 15 min.
4. SDS-PAGE
- Während Gelstreifen wird Abschrecken herzustellen SDS-PAGE Gellösungen nach Standardmethoden 9. Nicht Polymerisationsreagentien hinzuzufügen.
- Nach dem Abschrecken auf Raumtemperatur zurückkehren die ΒΝ Gelstreifen, und der Streifen in eine neue Gelkassette gegossen.
- Um dies zu tun, nehmen Sie vorsichtig das Gel und legen Sie sie auf eine saubere Gelkassette Distanzplatte.
- Orient der Streifen , so dass die Unterseite der Farbstofffront ist am nächsten an der Spitze der neuen Kassette (dh die Seite, die am weitesten in BN-PAGE gereist sollte auf der Oberseite der neuen Kassette am nächsten ist, der Gelstreifen aus seiner vorherigen umgedreht werden soll Orientierung). Siehe Abbildung 3.
- Platzieren Sie den Streifen so , dass seine Oberkante liegt auch bei denen die Oberkante der Abdeckplatte wird ( das heißt, es wird an der Oberseite des neuen Gel sein). Sicherstellen, dass die Farbstofffront parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte.
- Schieben einer Seite des ausgeschnittenen Streifens gegen einen der Abstandshalterwände, so dass Raum für ter andere Seite für Gel gegossen werden und ein Protein-Standard oder Leiter geladen werden.
- Wenn die Unterkante des Gelstreifens irgendwelche gezackten oder unebene Bereiche enthält, schneiden sie sorgfältig entfernt. Falls vorhanden, werden diese Blasen während trap Gelgießlösung.
- Sobald die Gelstreifen korrekt positioniert ist, legte die Abdeckplatte über die Distanzplatte. Drücken Sie vorsichtig heraus drücken alle eingeschlossenen Luftblasen.
- Weiterhin die gel-Gießvorrichtung nach Herstelleranleitung montieren.
- Hinzufügen Polymerisation Reagenzien zu dem Trenngel-Puffer und gießt es in die vorbereitete Gelkassette eine serologische Pipette. Füllen Sie das Gelkassette auf ~ 2 cm unterhalb der ausgeschnittenen BN-PAGE Gelstreifen, Raum für die Stapelung Schicht zu verlassen.
- Füge 100 & mgr; l Butanol über die oberen Rand des Gels gegossen, und ermöglicht es 30 Minuten zur Polymerisation des Auflösungsschicht. Gießen Sie das Butanol aus.
- In Polymerisationsreagentien zur Stapel Gel - Lösung. Mit einem serologische Pipette, gieße die Stapelschicht alle verbleibenden Leerraum in der Gelkassette zu füllen.
- Neigen die Gelkassette als die Stapelschicht gegossen wird, so dass er den Raum unterhalb des Gelstreifens füllt, und Luftblasen werden nicht aufgefangen.
- Da die Stapelung Gelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen füllt, kehrt allmählich die Gelkassette auf Augenhöhe.
- neben dem exzidierten Gelstreifen mit dem Stapel Gelpuffer, bis es fast überläuft weiterhin den leeren Raum zu füllen.
- Ermöglicht die Stapelschicht für 30 Minuten zu polymerisieren.
HINWEIS: Stellen 10x SDS-PAGE-Laufpuffer (250 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), 1,9 M Glycin, 1% SDS), während das Gel polymerisiert. Dies kann auch im Vorfeld und bei Raumtemperatur gelagert gemacht werden. - Verdünne 50 mL 10X - SDS-PAGE - Laufpuffer Lager in 450 ml dH 2 O 1x Arbeitspuffer zu machen.
- Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, entfernen Sie die Gelkassette von strömendemVorrichtung, Spülen mit dH 2 O, und montiert die Elektrophoresevorrichtung nach Herstelleranweisungen.
- Füllen der inneren Kammer vollständig mit 1x SDS-PAGE-Laufpuffer, dann die Außenkammer durch den Hersteller angegeben auf das Niveau füllen.
- Laden den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einem Molekulargewicht Leiter oder geeigneten Proteinstandard.
- Befestigen der Elektroden an die Stromversorgung, und Elektrophorese der Proben bei 120 V. Wenn der Farbstoff Coomassie das Gel abläuft, stoppen und die Stromversorgung trennen.
- Analysieren des Gels unter Verwendung von Standardverfahren des Elektroblotting und Proteindetektion durch Antikörperbindung 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar sind, ist die beobachtete höhere Molmassenfraktionen Bedeutung haben , durch das Vernetzungsreagenz gebildet wird , und sind nicht auf irgendeine andere Komponente des Protokolls (1A) . Zweitens zeigen wir , dass eine Vernetzung der Zugabe von Detergentien (1B) empfindlich ist, das heißt die Vernetzung ist spezifisch für komplexierte Proteine und dass zufällige Reaktivität aufgrund der Nähe auf dem Gel zu schließen , minimiert wird. Abbildung 2 zeigt , dass das Verfahren bzw. zur Erfassung fehlschlägtiratory Komplex II, hat aber sonst eine breite Anwendbarkeit für die Erfassung sowohl lösliche als auch membrangebundenen Komplexen.
Abbildung 1: Validierung der Multimer-PAGE - Methode. (A) Erfassung von Protein - Komplexen , die durch in-Gel - Vernetzung mit DSP ist empfindlich gegenüber Spaltung durch Dithiothreitol (DTT). Multimer-PAGE wurde an ganzen Rattenhirn ohne Lysat (A1) durchgeführt oder mit (A2), 5 mM Dithiothreitol in Tris / SDS Abschrecklösung enthalten. Das Gel wurde auf PVDF-Membranen elektrogeblottet und dann für Kinesin schweren Kette sondiert. Ein hohes Molekulargewicht Band ist auf beiden Membranen beobachtet, wahrscheinlich auf alle oder einen Teil des Kinesin Motorproteinkomplex entspricht. Es gibt eine zusätzliche Bande bei 126 kDa auftritt, auf dem DTT-behandelte Blot, die Molekularmasse des Kinesin-schweren Kette-Peptid. Dithiothreitol ist ein Reduktionsmittel, und ist in der Lage cr zu umkehrenoss Vernetzung durch die Disulfidbindung in DSP spalten. Das Kinesin-Aggregat ist daher empfindlich gegenüber Spaltung durch DTT. (B) Proteinkomplex capture ist empfindlich gegenüber Zusatz von Detergenzien zu denaturieren. Multimer-PAGE wurde an ganzem Rattenhirn-Lysats durchgeführt, wie im Text beschrieben, mit der Ausnahme steigender Mengen (0 bis 2%) von SDS (links) oder Triton X-100 (rechts) wurden zu dem Lysat Proben zugegeben, und dann auf Eis inkubiert 30 Minuten vor dem ersten Gel geladen. Die fertigen Gele wurden auf PVDF-Membranen geblottet und für α-Synuclein sondiert. Mindestens drei Banden von zunehmendem Molekulargewicht beobachtet werden, entspricht, a-Synuclein-Monomer, Tetramer und Octamer, respectively. Die Signalintensitäten der oligomeren Bänder nimmt mit Waschmittelkonzentration zunimmt, was anzeigt, dass Vernetzungs Wirksamkeit von nativen Proteinkonformation abhängt. Bitte klicken Sie hier , um view eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Nachweis der Einnahme von Proteinkomplexen unter Verwendung von Multimer-PAGE. (A) lösliche und membrangebundene Protein - Komplexe wurden von (A) insgesamt Rattenhirn - Lysat oder (B) Lysat mit 2% Digitonin für 1 h bei 4 ° C, durch Durchführen eines Multimer-PAGE inkubiert erfaßt , wie im Text beschrieben. Die Gele wurden dann abgetupft und die PVDF-Membranen für die Komponenten der verschiedenen Komplexe sondiert. Hochmolekularen Spezies wird auf dem für acetyliertes Tubulin sondiert Membran beobachtet wird, von dem bekannt ist Mikrotubuli zu stabilisieren. Dynein und Kinesin sind Multi-Untereinheit-Motor-Protein-Komplexe mit Molekulargewichten von 1,5 MDa und 380 kDa, respectively. Die Membranen für die Komponenten dieser Komplexe geblottet zeigen hochmolekulare Spezies. Zusätzlich Multimer-PAGE erfolgreich captured den HSP90-Dimer. & agr; -Synuclein bildet Tetramere und Octamere sowie neurotoxischen hochmolekulare Oligomere. Der Octamer und ein Streifen von höhergewichtigen Spezies sind auf der geblotteten Membranen gesehen. VDAC Dimerisierung wird auch beobachtet. Hochmolekularen Spezies werden auf den für die Komponenten der mitochondrialen Komplexen I und IV geblotteten Membranen nachgewiesen. Jedoch geblottet die Membran für SDHA, ein Mitglied des Komplexes II, keine geeignete hochmolekulare Bande zeigen. AcetTUB: acetyliertes α-Tubulin; βTUB: β-Tubulin; Dynein: dynein schwere Kette; HSP90: heat shock protein 90; Kinesin: Kinesin schwere Kette; NDUFS3: Eisen-Schwefel-Zentrum 3 des mitochondrialen Komplex I; VDAC: porin; SDHA: Succinat-Dehydrogenase der mitochondrialen Komplexes II; COXIV: Cytochrom C-Oxidase mitochondrialer Komplex IV. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3: Allgemeine Multimer-PAGE Flussdiagramm. (A) Bereiten Gewebelysat unter Verwendung von nicht-denaturierenden Methoden, wie Homogenisieren in BN-PAGE - Probenpuffer. (B) Die Pipetten - Lysat in BN-PAGE - Gel, dann durchführt Elektrophorese (150 Volt) in BN-PAGE - Laufpuffer. Erlauben Probe zu wandern, bis die Farbstofffront ~ 2 cm in das Trenngel gewandert ist. (C) Entfernen Sie die Stapelschicht und ungenutzten Teil der Auflösungsschicht. (D) das Versenken Gelstreifen in PBS, und Äquilibrieren mit 30 min Schütteln. (E) Entfernen des PBS und erneut unterzutauchen den Gelstreifen in PBS , enthaltend 2,5 mM DSP. Schütteln für 30 min. (F) Entfernen DSP - Lösung, dann erneut unterzutauchen die Gelstreifen in 375 mM Tris , enthaltend 2% SDS und Schütteln für 30 min. Komplexe, die in dem Gelstreifen werden nun von Cros stabilisiertess-Anbindung. (G) drehen , das Gel 180 ° und in ein neues SDS-PAGE - Gel Gußbandes. Fügen Sie sowohl Stapel- und Auflösungsschichten. (H) Lösen Probe durch Elektrophorese (120 Volt). (I) Entfernen Gelstreifen und Stapelschicht, dann analysiert wie nötig Auflösungsschicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein 11 bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2 gezeigt. Im Vergleich zu anderen Methoden der Proteinkomplexe zu studieren, Multimer-PAGE ist wegen seiner Einfachheit und Kürze vorteilhaft. Die Zeit von der Gewebeprobe vollständig getrennt SDS Gel etwa 8 h ist. Da Erkennung von typischem Western-Blot durchgeführt werden kann, kann das Protokoll auf unmodifizierten Gewebelysat durchgeführt werden, mit Nachweisgrenzen viel niedriger als die mit Pull-Down-Experimenten verbunden. Zusätzlich sind die meisten gut ausgestattete Molekularbiologie Laboratories in der Lage, die Technik mit wenig Vorab-Investition durchzuführen. Wie später diskutiert wird, kommt die größte Teil der Herausforderung mit Multimer-PAGE im Zusammenhang mit der Fehlersuche und das Verfahren für jeden Protein-Komplex untersucht zu optimieren.
Während Multimer-PAGE zu dem meisten Molekularbiologen zugänglich sein soll, ist ihr Erfolg auf den Forscher Geschick und Erfahrung abhängig. Kritisch muss das Schneiden und Wieder Gießen des BN Gelstreifen in das neue SDS-Gel mit Vorsicht durchgeführt werden. Es ist wichtig, die Gelstreifen zu orientieren, so daß die Elektrophorese verursacht Proteine in SDS-Gel in parallelen Bänder zu migrieren. Wenn der Gelstreifen krummen gegossen wird, werden die Proteinbanden in einer anderen migrieren und Daten gehen verloren. Speziell für große Komplexe, Drehen der Gelstreifen bevor es in das SDS-PAGE-Gel Gießen ist ähnlich wichtig. Dies ergibt größere Komplexe, die in das BN-PAGE-Gel, mehr Zeit gezogen werden in die Lösung Laye können nicht sehr weit gewandert sindr des SDS-PAGE-Gels. Wichtig ist, verursacht die Änderungen an Proteingröße und physikalischen Eigenschaften durch Vernetzung sollte auch während der Analyse berücksichtigt werden. Zum Beispiel sind einige niedermolekulare Proteine, wie α-Synuclein, sind nicht gut auf PVDF Membranen zurückgehalten, aber ihre vernetzte Oligomere sind 12. Dies kann eine vergleichende Analyse durcheinander bringen und müssen berücksichtigt werden.
Wenn ein Komplex von Multimer-PAGE zum ersten Mal zu trennen, ist es wichtig, das Verfahren zu validieren. Wir schlagen vor, drei Validierung / Fehlerbehebung Tests. Zunächst sicher, dass das Peptid von Interesse in das BN-Gel wandert durch Befolgen des Multimer-PAGE-Protokolls, bis Exzision des Gelstreifens, dann stoppen, wobei die Streifen auf einem PVDF-Membran blot und für die Untereinheit von Interesse untersuchen. Wenn kein Signal vorhanden ist, wahrscheinlich der Komplex migrierte nicht in das BN-Gel, das heißt, es sollte mehr porös gemacht werden, oder die Probe sollte weiter in die resolv wandern gelassen werdening Schicht. Vorhandensein eines Signals wird bestätigt, dass mindestens ungebundene Untereinheit in das Gel migriert. Zu diesem Zeitpunkt wird es schwierig sein, das Vorhandensein des vollständigen Komplexes zu bestätigen. Wenn der Nachweis der Untereinheit in dem BN-Gelstreifen detektiert wird, bewegen sich auf den zweiten Test auf. Führen Multimer-PAGE ohne Vernetzungsschritt, dann auf eine PVDF-Blot-Membran und der Sonde für die Untereinheit. Die Untereinheit sollte in Gegenwart von SDS und wandert normalerweise in das SDS-Gel denaturiert. Wenn dies nicht der Fall, gibt es wahrscheinlich ein Problem mit der Technik des Forschers. Die BN Gelstreifen wurden möglicherweise schlecht geschnitten, hinter einem Protein zu verlassen, oder das SDS-Gel falsch gegossen wurde. Schließlich führt Multimer-PAGE mit einem eingeschlossenen Vernetzers Spaltungsschritt, dann Blot und Sonde, wie in 1 diskutiert. Dies bestätigt die Aggregation des Komplexes Zugabe von DSP zurückzuführen ist, und nicht eine unerwartete Konsequenz aus einem anderen Teil des Multimers-PAGE-Protokolls. Die Spaltung sollte in einer Folge reduzierend-intensity Aggregat Band und eine erhöhte Intensität -Untereinheit Monomerbande Bei der Bilderzeugung. Wenn kein Aggregat Band aus normaler Multimer-PAGE zu sehen ist, aber die Monomerbande an Intensität zunimmt, wenn DSP abgespalten wird, hat der Komplex wahrscheinlich, es zu dem SDS-Gel hergestellt, aber nicht in die Auflösungsschicht zu migrieren.
In ihrem gegenwärtigen Zustand ist Multimer-PAGE auf viele Proteinkomplexe anwendbar, ist aber nicht ein one-size-fits-all-Protokoll. Es muss wahrscheinlich für jeden Komplex von Interesse modifiziert werden. Ein häufiges Problem ist in Abbildung 2 gezeigt: Erfasst-Komplexe sind oft so groß, dass sie kaum auf SDS-PAGE wandern. Dies kann durch Änderung der Porosität des SDS-Gel-Elektrophorese oder Durchführung für längere Zeiträume verwaltet werden. Eine zusätzliche Komplikation ist die gelegentliche Anwesenheit von mehr als zwei Banden auf dem Gel. Unvollständige Reaktion mit dem Vernetzer kann in einer Verteilung von mittlerem Molekulargewicht Bänder 13 führen. Dies kann es difrig, um zu bestimmen, ob mehrere Bänder von physiologisch wichtigen oligomere Zwischenprodukte repräsentativ sind, oder einfach unbeabsichtigten Folgen von Teilvernetzung. Für Membranproteine, die vor der Analyse in Lösung gebracht werden müssen, ist es auch wichtig, um die Auswirkungen zu berücksichtigen, dass die Wahl des Waschmittels auf dem Verhalten von Proteinkomplex aufweist. Das verwendete Detergens - Membranproteine solubilisieren wirkt sich auf ihre Konformationen, Verbände mit Bindungspartnern, und Funktionen 14, 15. Waschmittel Wahl hat auch Auswirkungen auf die Wirksamkeit von 16 Vernetzungs. Somit ist es wahrscheinlich, dass die idealen Bedingungen lösungsvermittelnde mit dem Komplex untersucht variiert werden.
Multimer-PAGE nicht gelegentlich einen Komplex zu erfassen, wie es auf dem SDHA blot in Figur 2 Succinate-Dehydrogenase gezeigt wird, ist ein Teil der 124 kDa mitochondrialen Complex II, die klein genug ist, dass sie leicht in das Gel bewegen sollen.Dass es nicht erkannt wurde zeigt, dass Multimer-PAGE war nicht in der Lage, es zu erfassen. Fälle wie diese haben viele mögliche Erklärungen. Die meisten Vernetzungsreagenzien enthalten zwei reaktive Enden, die mit Aminosäure-Seitenketten kovalente Bindungen bilden. Die Effizienz, mit der Vernetzungsreagenzien capture Proteinkomplexe sind abhängig von ihrer Zugänglichkeit zu reaktiven Resten. Im Fall der DSP der Vernetzung wird durch Acylierung von Lösungsmitteln-exponierten primären und sekundären aliphatischen Aminogruppen erreicht, in der Regel der ε-Aminogruppen von Lysin 17. Lysin - Reste werden in der Regel auf der Proteinoberfläche gefunden, aber ihre gelegentliche Sequestrierung in hydrophoben Zentren verringert die Effizienz der Vernetzungs 13. Die Untereinheiten des Komplexes II sind in der mitochondrialen Membran begraben und kann auf DSP, auch nach der Solubilisierung mit Digitonin 18 unzugänglich bleiben. Sehr große und dichten Verpackungskomplexe wie Amyloid oligomers, kann auch die Verfügbarkeit von Oberflächenlysinresten an Vernetzungsreagenzien begrenzen. Als Ergebnis können diese Arten von Protein-Baugruppen nicht mit Multimer-PAGE kompatibel sein. Es ist auch möglich , dass Coomassie Blau, die an hydrophobe Bereiche und kationischen Reste verbindet, in PBS blockiert und Vernetzung in einigen Fällen nach der Äquilibrierung 19 verweilt. Dies könnte den Nachweis von Oligomeren beeinflußt durch Multimer-PAGE verringern oder beseitigen. Somit ist das Verfahren nicht ein universelles Assay für alle Protein-Assoziationen Charakterisieren und soll nicht in Betracht gezogen werden, wo die Quantifizierung in erwünscht. Jedoch ist Multimer-PAGE ein kostengünstigen, relativ schnellen Werkzeugproteinkomplexe für die Analyse und kann neben anderen Mitteln festgelegt betrachtet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Unterstützt durch die NIH / NIDA DA034783. Wir danken Bryan A. Killinger für technische Unterstützung bei der Multimer-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
