Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen
Summary
Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass ein kleiner Prozentsatz (1-5 %) von mesenchymalen Stammzellen (MSC) intravenös injiziert oder intraperitoneal beherbergt die entzündeten Darm1,2. Diese Studie zeigt, dass Ultraschall-geführte intrakardiale Injektionen von MSCs erhöhte Lokalisierung in den Darm führen.
Abstract
Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm. Murinen und menschlichen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) immunsuppressive Potential haben und haben gezeigt, dass unterdrücken Entzündung Mausmodellen der Darmentzündung, obwohl die Art der Verabreichung ihre Homing und Wirksamkeit 1 einschränken können , 3 , 4 , 5. lokale Anwendung von MSCs Kolon Verletzungen Modelle hat höhere Wirksamkeit bei Entzündungen im Dickdarm bessernde gezeigt. Allerdings gibt es Mangel an Daten über Techniken, um die Lokalisierung von menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) in den Dünndarm, Entzündungsherd im SAMP-1/YitFc (SAMP) Modell der experimentellen Morbus Crohn zu verbessern. Diese Arbeit beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs bei Mäusen SAMP gut charakterisierten spontane Modellcharakter für die chronische Darmentzündung. Geschlecht und Alter-abgestimmt, Entzündungen-freie AKR/J (AKR) Mäuse dienten als Kontrollen. Um die Bioverteilung und die Lokalisierung zu analysieren, wurden hMSCs mit einen Lentivirus mit einem dreifachen Reporter ausgestrahlt. Die dreifache Reporter bestand aus Firefly Luciferase (fl), für die Biolumineszenz Bildgebung; Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (Mrfp), für die Zelle Sortierung; und imaging-abgeschnittene Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (Ttk), für Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass 24 h nach der intrakardialen Verabreichung hMSCs im Dünndarm von SAMP Mäusen im Gegensatz zu Entzündungen-freie AKR Mäuse zu lokalisieren. Dieser Roman, Ultraschall-gesteuerte Injektion von hMSCs in der linken Herzkammer von SAMP Mäusen sorgt für eine hohe Erfolgsquote bei der Zelle Lieferung, so dass für die rasche Erholung von Mäusen mit minimalen Morbidität und Mortalität. Diese Technik könnte eine nützliche Methode für die verbesserte Lokalisierung von MSCs in anderen Modellen von klein-Darm-Entzündung, z. B. TNFΔRE6. Zukünftige Studien bestimmt, ob die erhöhte Lokalisierung des hMSCs durch die intra-arterielle Lieferung zu erhöhten therapeutische Wirksamkeit führen kann.
Introduction
Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm und wird gedacht, um daraus eine unangemessene Reaktion des Immunsystems Host auf Darm Mikroben7,8. Jüngste Studien haben gezeigt, dass sowohl menschliche als auch murinen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) Entzündung Mausmodellen Darmentzündung1,3,4,5unterdrücken können. Es gibt mehrere laufende klinische Studien, mit denen menschliche MSCs abgeleitet aus Knochenmark oder Fettgewebe zur Behandlung von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die CD9umfasst. Zwei Routen für MSC-Therapie in diesen klinischen Studien verwendet wurden: eine beinhaltet die systemische Infusion (z.B. intravenös) von MSCs luminalen IBD (inkl. CD), und der andere umfasst die lokalisierte Anwendung/Injektion von Stammzellen in die Fistel von Patienten mit perianale CD-Darm-Trakt. In einer aktuellen Meta-Analyse der MSC-Therapie für IBD, systemische (z.B. intravenös) MSC Therapie für luminalen IBD (inkl. CD) war wirksam in bis zu 40 % (95 % CI: 7-79 %) der Patienten, während die Wirksamkeit viel höher, bei 61 war % (95 % CI: 36-85 %), wenn die MSCs die erkrankten CD Fistel9wurden lokal injiziert werden. Eine jüngste Phase-III-Multicenter randomisierte Placebo-kontrollierte Studie von allogenen Fettgewebe Stammzellen direkt in die perianale Fistel CD Patienten statistisch signifikante klinische und radiologische Anzeichen von perianale Fisteln heilen injiziert, die Ergebnisse der Meta-Analyse10erhärten. Die Gründe für die geringe Wirksamkeit der MSC Therapie intravenös für luminalen CD wurde nicht ausreichend untersucht, aber möglicherweise ein Grund der unzureichenden Homing von MSCs an den Ort der Entzündung. Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass nur ein kleiner Prozentsatz der MSCs (1-5 %) intravenös injiziert erreichen den entzündeten Darm; die restlichen MSCs durch die Lungen (First-Pass-Effekt)1,2 gefiltert werden ,5,11,12. Mehreren murinen Studien haben daher die intraperitoneale Route (i.p.) für MSC Verwaltung in Tiermodellen der Kolitis4verwendet. Sie haben jedoch auch gezeigt, dass nur ein kleiner Bruchteil der Zellen zu erreichen und weiterhin den Doppelpunkt und, dass die Wirksamkeit auf die Sekretion von löslichen parakrine Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-induzierbaren Gen 6 Protein (TSG-6)2. Der MSC-Mechanismus der Immunsuppression und Heilung beinhaltet einen mehrgleisige Ansatz, parakrine; Zelle Nähe-unabhängige Faktoren wie TSG-6; und Zell-Nähe-abhängige Faktoren wie programmiert Tod-Liganden 1 (PD-L1); oder gezackt 1. Daher kann erhöhte Wirksamkeit9,13MSC Lokalisierung auf der Website der Entzündung führen. In der Tat zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass MSCs direkt auf dem Gelände des Kolon Verletzungen implantiert Heilung durch Sekretion Förderung der Angiogenese vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) führte. Auf der anderen Seite wurde eine minimale heilende Wirkung nach intravenöser Injektion5festgestellt. Um ihre Lokalisierung auf der Website der Entzündung (d. h. den Dünndarm in SAMP Mäuse) zu erhöhen, wurde diese Ultraschall-geführte intrakardialen Injektionstechnik für MSC-Verwaltung in die linke Herzkammer entwickelt. Bildgestützte Einspritzung sorgt für eine präzise Einspritzung, die führt zu einer höheren Erfolgsquote und sank auf Morbidität und Sterblichkeit. Darüber hinaus liefert sie die Injektion von MSCs in die linke Herzkammer an arteriellen Kreislauf, wo sie die entzündeten Dünndarm erreichen kann, bevor er gefangen in der Lunge.
In dieser Studie wurden menschliche Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) für die Injektion in die SAMP-1/YitFc (SAMP) Mausmodell CD14verwendet. SAMP ist ein gut charakterisierten spontane Mausmodell der chronischen Entzündung, der klein-Darm-Entzündung mit fast 100 % Penetranz14entwickelt. Die Entzündung entwickelt sich in Reaktion auf die Mikroflora in Ermangelung jeglicher chemischen, immunologischen oder genetische Manipulation und ähnelt menschlichen CD11. Geschlecht und Alter abgestimmt Entzündung-freie AKR/J (AKR) Mäuse, die Kindersicherung Mäuse von SAMP, wurden in dieser Studie verwendet.
Die hMSCs wurden isoliert und im Labor aus dem Knochenmark (BM) Proben aus normalen, nicht identifizierte Spender nach Einwilligung validiert und zuvor Protokolle15,16 veröffentlichtenerweitert. Nach der Isolierung und Expansion, die MSC-Fähigkeit in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung wurde durch mehrere Tests15im Labor ausgewertet. Osteogene funktionelle Assays erfolgte durch Implantation von keramischen Würfel von Hydroxylapatit/Tricalcium-Phosphat-Matrix mit hMSCs subkutan in immungeschwächten CB17-Prkdc SCID Mäuse17. Der Cube-Test weist Osteogenesis und werden potenzielle und gilt als den ultimativen Test für die Bewertung der einzelnen MSC Vorbereitungen17. Um hMSCs in Vivo nach der Injektion zu visualisieren, wurde Lentivirus verwendet, um hMSCs mit dreifach Reporter Genkonstrukt transduzieren, der Firefly Luciferase (fl), Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (mRFP) und Herpes-Simplex-Virus Thymidin-Kinase (Ttk besteht ), angetrieben durch eine modifizierte myeloproliferative Sarkom-Virus (Mnd) Projektträger18. Die Firefly Luciferase in der dreifachen Reporter ist ein Enzym, dass Coverts injizierten Luciferin zu Oxyluciferin in hMSCs und Photonen/Weißlicht erzeugt. Dies wird durch die sensible – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera (Biolumineszenz) in einem in Vivo optical imaging-System, ermöglicht die Visualisierung von live hMSCs bei Mäusen erkannt. Biolumineszenz imaging (BLI) ist eine sensible Technik, die serienmäßig für die Verfolgung von Zellen und für die ex-Vivo -Analyse verwendet werden kann. Die Verwendung eines starken Mnd-Promotors treibt den kontinuierlichen Ausdruck das Genkonstrukt triple Fusion Reporter und ermöglicht die Darstellung der injizierten hMSCs für mehr als 16 Wochen19. Die hMSCs sind schwer zu transduzieren und haben einen niedrigen Transduktion Wirkungsgrad. Mit einer optimierten Protokoll, hMSCs Transduktion Effizienz verbessert und die Expression des Transgens verbesserte18war. Mit mRFP Ausdruck (eines der drei Reporter Gene) auf Durchflusszytometrie, zeigte sich die Möglichkeit, hMSCs mit einem hohen Wirkungsgrad von bis zu 83 % transduzieren. Differenzierung-Assays und in Vivo Cube Assays zeigte die Fähigkeit von transduced hMSCs in Chondrozyten, Adipozyten und Osteozyten17zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs in einem kleinen Darm Mausmodell der experimentellen CD. Diese Technik hat sehr hohe Rate des Überlebens und Erfolg, da die Flugbahn der Nadel basierend auf Echtzeit-, hochauflösende Bilder des linken Ventrikels Maus, bereitgestellt durch den Ultraschall angepasst werden kann. Der Vorteil der Lieferung an die linke Herzkammer ist, dass hMSCs dann Intra arterially verteilt und venösen Kreislauf, wodurch die Aggreg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave wird vom US-Verteidigungsministerium Grant PR141774 und der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award unterstützt. Das Labor von Fabio Cominelli stützt sich auf NIH DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) und DK07948 (F.C.) gewährt. Das Labor von Arnold Caplan wird teilweise von David L. und E. Virginia Baldwin Foundation unterstützt. Förderinstitutionen hatte keine Rolle bei der Analyse der Studie oder Schreiben des Manuskripts. Deren Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
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