Ultrasuono-guida di iniezione intracardiaca di cellule staminali mesenchimali umane per aumentare Homing all'intestino per l'utilizzo in modelli murini di malattie intestinali infiammatorie sperimentali
Summary
Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che una piccola percentuale (1-5%) di cellule staminali mesenchimali (MSC) iniettato per via endovenosa o intraperitonealmente ospita il colon infiammato1,2. Questo studio indica che le iniezioni intracardiache ultrasuono-guida di MSCs provocare maggiore localizzazione all’intestino.
Abstract
Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) murine ed umane hanno potenziale immunosopressivo e sono state indicate per sopprimere l’infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale, anche se la via di somministrazione può limitare loro homing ed efficacia 1 , 3 , 4 , 5. l’applicazione locale di MSCs per modelli di lesione colica ha mostrato una maggiore efficacia al miglioramento dell’infiammazione del colon. Tuttavia, c’è scarsità di dati sulle tecniche per migliorare la localizzazione di MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) all’intestino tenue, il sito di infiammazione nel modello SAMP-1/YitFc (SAMP) del morbo di Crohn sperimentale. Questo lavoro descrive una nuova tecnica per l’iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in topi SAMP, un modello ben caratterizzato spontaneo di infiammazione intestinale cronica. Sesso ed età-abbinato, senza infiammazione AKR/J (AKR) topi sono stati usati come controlli. Per analizzare la biodistribuzione e la localizzazione, hMSCs erano trasdotte con un lentivirus contenente un reporter triplo. Il reporter triplo consisteva di luciferasi di lucciola (fl), per l’imaging bioluminescenti; proteina fluorescente rossa monomerica (mrfp), per l’ordinamento delle cellule; e troncato herpes simplex virus timidina chinasi (ttk), per l’imaging di tomografia a emissione di positroni (PET). I risultati di questo studio mostrano che 24 h dopo la somministrazione intracardiaca, hMSCs localizzare nell’intestino tenue dei topi SAMP al contrario di topi AKR senza infiammazione. Questo romanzo, iniezione ultrasuono-guida di hMSCs nel ventricolo sinistro dei topi SAMP garantisce un alto tasso di successo di consegna cella, consentendo il rapido recupero dei topi con la mortalità e la morbosità minima. Questa tecnica potrebbe essere un metodo utile per la localizzazione avanzata delle MSC in altri modelli di infiammazione piccolo-intestinale, quali TNFΔRE6. Gli studi futuri determinerà se la maggiore localizzazione di hMSCs di consegna intra-arteriosa può portare a una maggiore efficacia terapeutica.
Introduction
Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino ed è pensato per derivare da un’inadeguata risposta del sistema immunitario dell’ospite a microbi intestinali7,8. Recenti studi hanno dimostrato che cellule staminali mesenchimali (MSCs) sia murine ed umane possono sopprimere l’infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale1,3,4,5. Non ci sono più studi clinici in corso che utilizzano MSCs umane derivate da midollo osseo o tessuto adiposo per il trattamento di pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), che include CD9. Due percorsi per la terapia di MSC sono stati utilizzati in questi studi clinici: uno riguarda l’infusione sistemica (cioè, per via endovenosa) di MSCs per IBD luminal (incluso CD) e l’altro prevede l’applicazione localizzata/iniezione di cellule staminali in fistola tratto di pazienti con CD perianale. In una recente meta-analisi della terapia MSC per IBD, sistemico (cioè, per via endovenosa) terapia MSC per IBD luminal (incluso CD) era efficace in fino a 40% (IC 95%: 7-79%) dei pazienti, mentre l’efficacia era molto più alto, al 61% (95% CI: 36-85%), quando MSCs sono stati iniettati localmente nel malato CD fistola9. Uno studio multicentrico di fase recente III randomizzato controllato verso placebo di cellule staminali allogeniche adipose iniettato direttamente nella fistola perianale di CD pazienti hanno mostrato statisticamente significativa prova clinica e radiologica delle fistole perianali, guarigione, che confermano i risultati delle meta-analisi10. Le ragioni per la bassa efficacia della terapia MSC data per via endovenosa per CD luminal è stato adeguatamente studiato, ma uno dei motivi potrebbe essere l’homing inadeguata delle MSCs al sito di infiammazione. Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che solo una piccola percentuale di cellule staminali mesenchimali (1-5%) iniettato per via endovenosa raggiungono il colon infiammato; MSCs rimanenti vengono filtrati dai polmoni (effetto di primo passaggio)1,2 ,5,11,12. Più studi di ricerca murino quindi usato la via intraperitoneale (i.p.) per la somministrazione di MSC in modelli animali di colite4. Tuttavia, essi hanno anche dimostrato che solo una piccola frazione delle cellule di raggiungere e attecchire il colon e che l’efficacia è collegata alla secrezione di fattori paracrini solubili, come proteina di fattore di necrosi tumorale-inducible gene 6 (TSG-6)2. Il meccanismo MSC di immunosoppressione e guarigione comporta un approccio multipronged che coinvolge paracrina; fattori di prossimità-indipendente delle cellule, come STG-6; e fattori di prossimità-dipendente, cellulare come programmato la morte-legante 1 (PD-L1); o Jagged 1. Localizzazione di MSC al sito di infiammazione può pertanto efficacia aumentata9,13. Infatti, un recente studio ha mostrato che MSCs impiantati direttamente presso il sito della lesione colica provocato la guarigione secernendo promuovere l’angiogenesi endoteliali fattore di crescita vascolare (VEGF). D’altra parte, un effetto di guarigione minimo è stato notato dopo iniezione endovenosa5. Per aumentare la loro localizzazione al sito di infiammazione (cioè, il piccolo intestino in topi SAMP), è stata sviluppata questa tecnica di iniezione intracardiaca ultrasuono-guida per l’amministrazione di MSC nel ventricolo sinistro. Immagine-guida iniezione assicura un’iniezione precisa, che conduce ad un più alto tasso di successo e diminuita morbilità e mortalità. Inoltre, l’iniezione di cellule staminali mesenchimali nel ventricolo di sinistra li recapita alla circolazione arteriosa, dove si possono raggiungere il piccolo intestino infiammato prima di diventare intrappolati nei polmoni.
In questo studio, MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) sono stati usati per l’iniezione nel modello murino di SAMP-1/YitFc (SAMP) di CD14. SAMP è un modello murino spontaneo ben caratterizzato di infiammazione cronica che si sviluppa l’infiammazione di piccolo intestino con quasi 100% penetranza14. L’infiammazione si sviluppa in risposta alla microflora in assenza di qualsiasi manipolazione chimica, immunologici o genetici e umana CD11è molto simile. Pari età e del sesso senza infiammazione AKR/J (AKR) topi, topi di controllo parentale di SAMP, sono stati usati in questo studio.
Il hMSCs sono stati isolati e ampliato in laboratorio da campioni di midollo osseo (BM) ottenuti da donatori normali, non identificati dopo consenso informato utilizzando validati e pubblicati in precedenza protocolli15,16. Dopo isolamento ed espansione, la capacità MSC in osteogenica, adipogenico, differenziazione chondrogenic è stata valutata in laboratorio da più saggi15. L’analisi funzionale osteogenico è stato effettuato impiantando cubi in ceramica di idrossiapatite/tricalcio fosfato matrice contenente hMSCs sottocute in immunocompromised di topi SCID CB17-Prkdc17. Il dosaggio di cubo dimostra osteogenesi e Condrogenesi potenziali ed è considerato la prova definitiva per la valutazione individuale MSC preparazioni17. Per visualizzare hMSCs in vivo dopo l’iniezione, è stato utilizzato lentivirus trasduce hMSCs con costruzione di gene reporter triple che consiste di luciferasi di lucciola (fl), la proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP) e chinasi della timidina virale di simplex di erpete (ttk ), guidato da un modificate myeloproliferative sarcoma virus (mnd) promotore18. La luciferasi di lucciola al reporter triple sono un enzima che luciferina iniettato copritrici a ossiluciferina in hMSCs e produce luce fotoni/bianco. Questo è rilevato dalla telecamera sensibile charge coupled device (CCD) (bioluminescenza) in un in vivo optical imaging sistema, consentendo la visualizzazione di live hMSCs in topi. Bioluminescenza imaging (BLI) è una tecnica sensibile che può essere utilizzata in serie per tenere traccia delle cellule e per l’analisi ex vivo . L’uso di un promotore forte mnd spinge l’espressione continua della costruzione di gene reporter triple fusion e consente l’imaging delle hMSCs iniettato per più di 16 settimane19. Il hMSCs sono difficili da trasdurre e hanno un’efficienza di trasduzione basso. Utilizzando un protocollo ottimizzato, è stata migliorata l’efficienza di trasduzione hMSCs e l’espressione del transgene è stata rafforzata18. Utilizzando mRFP espressione (uno dei geni reporter triple) in citometria a flusso, è stata dimostrata la capacità di trasdurre hMSCs con un’alta efficienza di fino a 83%. In vivo cubo dosaggi e saggi di differenziazione ha dimostrato la capacità di differenziarsi in condrociti, adipociti e osteociti17il hMSCs trasdotte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio descrive una nuova tecnica per l’iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in un modello murino di piccolo intestino di CD sperimentale. Questa tecnica è molto alto tasso di sopravvivenza e di successo, come la traiettoria dell’ago può essere regolata in base in tempo reale immagini ad alta risoluzione del ventricolo sinistro del mouse, fornito dall’ecografia. Il vantaggio di consegna per il ventricolo sinistro è che hMSCs vengono poi distribuiti intra-arterialmente e bypassare la circolazione ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave è supportato dal dipartimento della difesa grant PR141774 e il Crohn e la colite Foundation di America Career Development Award. Il laboratorio di Fabio Cominelli è supportato da NIH concede DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) e DK07948 (F.C.). Il laboratorio di Arnold Caplan è sostenuto in parte da David L. ed E. Virginia Baldwin Foundation. Le agenzie di finanziamento non avevano alcun ruolo nell’analisi di studio di scrittura del manoscritto. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
