حقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية البشرية الخلايا الجذعية الوسيطة لزيادة صاروخ موجه للاستخدام في نماذج مورين من أمراض التهاب الأمعاء التجريبية للامعاء
Summary
وقد أثبتت الدراسات مورين في نماذج التهاب colonic أن نسبة مئوية صغيرة (1-5 ٪) من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) حقن الوريد أو إينترابيريتونيلي الرئيسية لالتهاب القولون1،2. وتبين هذه الدراسة أن حقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية من MSCs يؤدي إلى زيادة الترجمة إلى الأمعاء.
Abstract
داء كرون (CD) هو مرض التهاب مزمن شائع الصغيرة والأمعاء الغليظ. الخلايا الجذعية الوسيطة مورين والبشرية (MSCs) تتمتع بإمكانية كآبته، وقد ثبت أن قمع التهاب في نماذج الماوس من التهاب الأمعاء، على الرغم من أن مسار الإدارة يمكن أن يحد من صاروخ موجه وفعالية 1 , 3 , 4 , 5-التطبيق المحلي من MSCs لنماذج الإصابة colonic أثبتت فعالية أكبر في التخفيف من التهاب في القولون. ومع ذلك، هناك ندرة في البيانات المتعلقة بتقنيات لتعزيز إضفاء الطابع المحلي على MSCs المشتقة من نخاع العظام البشرية (همسكس) للامعاء الدقيقة، موقع التهاب في نموذج عصيدة-1/ييتفك (عصيدة) من داء كرون التجريبية. ويصف هذا العمل تقنية رواية لحقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية همسكس في الفئران عصيدة، نموذج عفوية تتسم جيدا لالتهاب الأمعاء المزمن. الجنس والعمر-المطابقة، خالية من التهاب الفئران عكر/J (عكر) استخدمت كعناصر تحكم. لتحليل بيوديستريبوشن والتعريب، كانت ترانسدوسيد همسكس مع لينتيفيروس التي تحتوي على مراسل ثلاثية. مراسل ثلاثية تتألف من اليراع لوسيفراس (فلوريدا)، لتصوير طرحه؛ البروتين أحادي الفلورسنت الأحمر (مرفب)، لفرز الخلايا؛ ويقطع الحلأ البسيط فيروس thymidine كيناز (ttk)، لتصوير التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET). تظهر نتائج هذه الدراسة أن ح 24 بعد الإدارة إينتراكاردياك، همسكس المعربة في الفئران عصيدة بدلاً من الفئران عكر خالية من التهاب الأمعاء. هذه الرواية، والاسترشاد بالموجات فوق الصوتية بالحقن همسكس في البطين الأيسر للفئران عصيدة يضمن نسبة نجاح عالية إيصالها الخلية، مما يتيح للانتعاش السريع للفئران مع أدنى معدلات الاعتلال والوفيات. هذا الأسلوب يمكن أن يكون وسيلة مفيدة لتعزيز توطين MSCs في نماذج أخرى من التهاب الأمعاء الصغيرة، مثل TNFΔRE6. وستحدد الدراسات المستقبلية إذا كان إضفاء الطابع المحلي على زيادة همسكس بايصالها داخل الشرايين يمكن أن يؤدي إلى زيادة الفعالية العلاجية.
Introduction
داء كرون (CD) هو مرض التهاب مزمن شائع الصغيرة والأمعاء الغليظ وهو يعتقد أن ينتج عن رد فعل غير مناسب من المضيف الجهاز المناعي للميكروبات المعوية7،8. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن الخلايا الجذعية الوسيطة مورين والبشرية على حد سواء (MSCs) يمكن منع التهاب في نماذج الماوس من التهاب الأمعاء1،3،،من45. وهناك عدة التجارب السريرية الجارية التي تستخدم MSCs البشرية المستمدة من نخاع العظام أو الأنسجة الدهنية لعلاج المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، الذي يتضمن القرص المضغوط9. طريقان للعلاج ماجستير وقد استخدمت في هذه التجارب السريرية: واحد ينطوي على ضخ الجهازية (أي عن طريق الوريد) من MSCs لبنك التنمية بين الأمريكتين لومينال (بما في ذلك مؤتمر نزع السلاح)، والآخر ينطوي على التطبيق المترجمة/حقن الخلايا الجذعية في ناسور الولادة المسالك للمرضى الذين يعانون من العجان مؤتمر نزع السلاح. في الأخيرة تحليل تلوي ماجستير العلاج لبنك التنمية بين الأمريكتين، الجهازية (أي، عن طريق الحقن الوريدي) ماجستير العلاج لبنك التنمية بين الأمريكتين لومينال (بما في ذلك مؤتمر نزع السلاح) كان ناجع بنسبة تصل إلى 40% (CI 95%: 7-79%) من المرضى، بينما الكفاءة أعلى بكثير، في 61% (CI 95%: 36-85%)، عندما MSCs تم حقن محلياً في الناسور CD المريضة9. معشاة متعددة الثالث مرحلة الأخيرة محاكمة وهمي تسيطر متمكنة من الخلايا الجذعية الدهنية حقنها مباشرة في الناسور العجان المرضى مؤتمر نزع السلاح قد أظهرت الأدلة السريرية والإشعاعية يعتد به إحصائيا من ناسور العجان الشفاء، تثبت نتائج التحليل التلوي10. أسباب تدني كفاءة ماجستير العلاج يعطي عن طريق الوريد لمؤتمر نزع السلاح لومينال تم التحقيق غير كافية، لكن قد يكون أحد الأسباب استضافة غير كافية أكثر من MSCs إلى موقع الالتهاب. وقد أثبتت الدراسات مورين في نماذج التهاب colonic أن فقط نسبة مئوية صغيرة من MSCs (1-5 ٪) حقن الوريد تصل إلى التهاب القولون؛ MSCs المتبقية يتم تصفيتها ب الرئتين (الأولى-تمرير الأثر)1،2 5، ،،من1112. ولذلك استخدمت عدة دراسات بحثية موريني الطريق داخل (القائمة) لإدارة لجنة السلامة البحرية في نماذج حيوانية لالتهاب القولون4. ومع ذلك، أظهرت أيضا أن فقط الوصول إلى جزء صغير من الخلايا وانجرافت القولون وأن الفعالية المتصلة بإفراز عوامل paracrine القابلة للذوبان، مثل البروتين الجينات عامل نخر الورم إيندوسيبلي 6 (TSG-6)2. إليه لجنة السلامة البحرية الكبت المناعي وشفاء ينطوي على نهج متعدد الجوانب يشمل paracrine؛ العوامل خلية مستقلة عن قرب، مثل TSG-6؛ والخلية تعتمد على القرب من العوامل، مثل المبرمجة الموت-يجند 1 (PD-L1)؛ أو 1 خشنة. ولذلك، ماجستير الترجمة إلى الموقع من التهاب قد يؤدي إلى زيادة كفاءة9،13. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة أن MSCs مباشرة مزروع في موقع الإصابة colonic أدت إلى الشفاء من إفراز تشجيع الأوعية والأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF). من ناحية أخرى، لوحظ تأثير شفاء الحد أدنى بعد الحقن الوريدي5. زيادة على الترجمة إلى الموقع الالتهاب (أي الأمعاء في الفئران عصيدة)، وضعت هذه تقنية حقن intracardiac الموجهة بالموجات فوق الصوتية لإدارة لجنة السلامة البحرية في البطين الأيسر. حقن الموجهة بصورة تكفل حقن دقيقة، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل النجاح، وإلى انخفاض معدلات الاعتلال والوفيات. وعلاوة على ذلك، توفر لهم حقن MSCs إلى البطين الأيسر للدورة الدموية الشريانية، حيث يمكن أن تصل إلى الأمعاء الملتهبة قبل أن تصبح المحاصرين في الرئتين.
واستخدمت في هذه الدراسة، MSCs المشتقة من نخاع العظام البشرية (همسكس) للحقن في نموذج مضغوط14موريني عصيدة-1/ييتفك (عصيدة). عصيدة هو نموذج موريني عفوية تتسم جيدا من التهاب مزمن يتطور التهاب الأمعاء الصغيرة مع ما يقارب 100% بينيترانسي14. الالتهاب يتطور استجابة لتبدل في غياب أي معالجة كيميائية أو مناعية أو الوراثية، ويشبه الإنسان CD11. الجنس والعمر مطابقة خالية من التهاب عكر/J (عكر) الفئران، الفئران السيطرة الأبوية لعصيدة، استخدمت في هذه الدراسة.
همسكس كانت معزولة وتوسعت في المختبر من عينات نخاع العظم (بي أم) التي تم الحصول عليها من المانحين العادية، ولم تحدد هويته بعد الموافقة المستنيرة باستخدام التحقق من صحة وسبق نشر البروتوكولات15،16. بعد عزلة والتوسع، فإن قدرة لجنة السلامة البحرية في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتم تقييم التمايز تشوندروجينيك في المختبر فحوصات متعددة15. وكان يؤديها المقايسة الوظيفية osteogenic غرس مكعبات السيراميك هيدروكسيباتيت/tricalcium الفوسفات مصفوفة تحتوي على همسكس تحت الجلد في الفئران “إخضاعها” CB17-بركدك المناعة17. والرزن المكعب يوضح تكون العظم وتشوندروجينيسيس المحتملة، ويعتبر الاختبار النهائي لتقييم الاستعدادات MSC الفردية17. تصور همسكس في فيفو بعد الحقن، استخدمت لينتيفيروس في ترانسدوسي همسكس مع بناء الجينات مراسل الثلاثي الذي يتكون من اليراع لوسيفراس (فلوريدا) والبروتين أحادي الفلورسنت الأحمر (مرفب) كيناز thymidine الفيروسية الحلأ البسيط (ttk )، مدفوعا مروج فيروس (وزارة الدفاع الوطني) ساركومه myeloproliferative معدلة18. لوسيفراس اليراع في المراسل ثلاثية إنزيم أن أطماع لوسيفرين حقن إلى أوكسيلوسيفيرين في همسكس وتنتج ضوء أبيض والفوتونات. وهذا الكشف عن بواسطة الكاميرا الحساسة جهاز اقتران (CCD) (الإضاءة الحيوية) في في فيفو بصري تصوير نظام، يمكن تصور همسكس يعيش في الفئران. الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) هو تقنية حساسة التي يمكن استخدامها متسلسل لتتبع الخلايا والتحليل السابقين فيفو . استخدام أحد المروجين القوى القوات المتعددة الجنسيات محركات التعبير المستمر عن بناء الجينات مراسل الانصهار الثلاثي ويسمح للتصوير من حقن همسكس لأكثر من 16 أسبوعا19. همسكس التي يصعب ترانسدوسي ولديها من كفاءة توصيل منخفضة. استخدام بروتوكول أمثل، تم تحسين كفاءة توصيل همسكس وكان التعبير التحوير المحسن18. باستخدام التعبير مرفب (أحد الجينات مراسل الثلاثي) على التدفق الخلوي، تجلى القدرة على ترانسدوسي همسكس مع كفاءة عالية ليصل إلى 83 في المائة. فحوصات التمايز و في فيفو فحوصات المكعب برهن على قدرة همسكس ترانسدوسيد تفرق في chondrocytes و adipocytes وأوستيوسيتيس17.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الدراسة تقنية جديدة لحقن همسكس في نموذج الفأرة صغيرة والأمعاء من القرص المضغوط التجريبي intracardiac الموجهة بالموجات فوق الصوتية. هذه التقنية بمعدل مرتفع جداً للبقاء على قيد الحياة والنجاح، كما يمكن تعديل مسار الإبرة استناداً إلى صور عالية الجودة وفي الوقت الحقيقي البطين الأيسر الما?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ديف مانيش معتمد من قبل وزارة الدفاع منحة PR141774 وكرون ومؤسسة التهاب القولون لجائزة التنمية المهنية الأمريكية. مختبر كومينيلي فابيو معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة ويمنح DK042191 (نادي)، DK055812 (نادي)، DK091222 (نادي) و DK07948 (نادي). مختبر “أرنولد كابلان” تدعمه في الجزء هاء فيرجينيا بالدوين مؤسسة وديفيد ل.. وكالات التمويل لا دور في تحليل الدراسة أو كتابة المخطوطة. محتوياته هي المسؤولة الوحيدة عن مقدمي البلاغ.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
