Ultralydsvejledt Intracardiac injektion af humane mesenkymale stamceller til at øge Homing til tarmen til brug i Murine modeller af eksperimentelle inflammatoriske tarmsygdomme
Summary
Murine undersøgelser i modeller af Colon betændelse har vist, at en lille procentdel (1-5%) af mesenchymale stamceller (MSC) injiceres intravenøst eller intraperitoneal hjem til den betændte kolon1,2. Denne undersøgelse viser, at ultralydsvejledt intracardiac injektioner af MSCs resultere i øget lokalisering til tarmen.
Abstract
Crohns sygdom (CD) er en fælles kronisk inflammatorisk sygdom i små og store tarmene. Murine og menneskelige mesenchymale til stamceller (msc) har immunosuppressive potentiale og har vist at undertrykke betændelse i musemodeller af tarmbetændelse, selvom indgiftsmåde kan begrænse deres målsøgende og effektivitet 1 , 3 , 4 , 5. lokal anvendelse af MSC’er til Colon skade modeller har vist større effekt på mildne betændelse i tyktarmen. Men der er mangel på data om teknikker til at forbedre lokalisering af menneskelige knoglemarv-afledte MSCs (hMSCs) til tyndtarmen, site af betændelse i SAMP-1/YitFc (SAMP) modellen af eksperimentelle Crohns sygdom. Dette arbejde beskriver en ny teknik for ultralyd-styrede intracardiac injektion af hMSCs i SAMP mus, en vel karakteriseret spontan model af kronisk tarmbetændelse. Køn og alder-matchede, inflammation-free RANDIS/J (RANDIS) mus blev brugt som kontrol. For at analysere biodistributionen og lokalisering, var hMSCs transduced med en lentivirus, der indeholder en tredobbelt reporter. Den tredobbelte reporter bestod af firefly luciferase (fl), for en bioluminescerende imaging; monomere rødt fluorescerende proteiner (mrfp), til celle sortering; og afkortet herpes simplex virus thymidine kinase (ttk), for positron emission tomografi (PET) imaging. Resultaterne af denne undersøgelse viser at 24 h efter intracardiac administration, hMSCs lokalisere i tyndtarmen af SAMP mus i modsætning til inflammation-free RANDIS mus. Denne roman, ultralydsvejledt injektion af hMSCs i venstre hjertekammer af SAMP mus sikrer en høj succesrate på celle levering, giver mulighed for hurtig inddrivelse af mus med minimal sygelighed og dødelighed. Denne teknik kunne være en nyttig metode til forbedret lokaliseringen af MSCs i andre modeller af små-tarm inflammation, såsom TNFΔRE6. Fremtidige undersøgelser vil bestemme, hvis den øgede lokalisering af hMSCs af intraarteriel levering kan føre til øget terapeutiske virkning.
Introduction
Crohns sygdom (CD) er en fælles kronisk inflammatorisk sygdom i små og store tarme og menes at skyldes en uhensigtsmæssig reaktion i immunsystemet vært til tarm mikrober7,8. Nylige undersøgelser har vist, at både murine og menneskelige mesenchymale til stamceller (msc) kan undertrykke betændelse i musemodeller tarmbetændelse1,3,4,5. Der er flere igangværende kliniske forsøg, som bruger menneskelige MSCs stammer fra knoglemarven eller fedtvæv til behandling af patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), som omfatter CD9. To ruter for MSC terapi har været brugt i disse kliniske forsøg: en indebærer den systemiske infusion (dvs. intravenøst) af MSCs luminale IBD (herunder CD), og den anden omfatter lokaliseret anvendelse/injektion af stamceller i fistlen tarmkanalen af patienter med endetarmsåbning CD. I en nylig meta-analyse af MSC terapi for IBD, systemisk (dvs., intravenøs) MSC terapi for luminale IBD (herunder CD) blev effektiv i op til 40% (95% CI: 7-79%) af patienter, der henviser til, at effekten var meget højere, på 61% (95% CI: 36-85%), når MSCs blev sprøjtet lokalt ind den syge CD fistel9. En nylig fase III multicenter randomiseret placebo kontrollerede forsøg af allogene adipøst stamceller injiceres direkte i perianal fistel CD patienter viste statistisk signifikant klinisk og radiologiske tegn på endetarmsåbning fistler healing, bekræfter resultaterne af meta-analyse10. Årsagerne til den lave effekten af MSC terapi gives intravenøst luminale CD er blevet utilstrækkeligt undersøgt, men en af grundene kan være den utilstrækkelige homing af MSC’er til stedet for betændelse. Murine undersøgelser i modeller af Colon betændelse har vist, at kun en lille procentdel af MSCs (1-5%) injiceres intravenøst nå betændte tyktarmen; de resterende MSCs er filtreret af lungerne (first-pass effekt)1,2 ,5,11,12. Flere murine forskningsundersøgelser har derfor brugt intraperitoneal ruten (i.p.) for MSC administration i dyremodeller for colitis4. De har imidlertid også vist, at kun en lille brøkdel af celler nå og indpode tyktarmen og at effekten er relateret til udskillelsen af opløselige paracrine faktorer, såsom tumor nekrose faktor-inducerbar gen 6 protein (TSG-6)2. MSC mekanisme af immunosuppression og healing indebærer en flerstrenget tilgang, der involverer paracrine; celle nærhed-uafhængige faktorer, som GTS-6; og celle nærhed-afhængige faktorer, ligesom programmeret død-ligand 1 (PD-L1); eller takkede 1. Derfor, MSC lokalisering til webstedet af betændelse kan resultere i øget effektivitet9,13. Faktisk viste en nylig undersøgelse, at MSC’er direkte implanteret i stedet for Colon skade resulterede i healing ved at udskille angiogenese-fremme vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). På den anden side blev en minimal helbredende effekt bemærket efter intravenøs injektion5. For at øge deres lokalisering til webstedet af betændelse (dvs., tyndtarmen i SAMP mus), blev denne ultralydsvejledt intracardiac injektionsteknik for MSC administration i venstre hjertekammer udviklet. Image-vejledt injektion sikrer en præcis indsprøjtning, hvilket fører til en højere sats for succes og at faldt sygelighed og dødelighed. Derudover leverer indsprøjtning af MSCs i venstre hjertekammer dem til arteriel omsætning, hvor de kan nå de betændte tyndtarmen før at blive fanget i lungerne.
I denne undersøgelse, blev menneskelige knoglemarv-afledte MSCs (hMSCs) brugt til injektion i den SAMP-1/YitFc (SAMP) murine model CD14. STEMPLET er en vel karakteriseret spontan murine model af kronisk inflammation, der udvikler små tarmbetændelse med næsten 100% penetrans14. Inflammation udvikler sig som reaktion på mikrofloraen i mangel af enhver kemisk, immunologisk eller genetisk manipulation og ligner menneskelige CD11. Sex – og alder-matchede inflammation-free RANDIS/J (RANDIS) mus, Børnesikring mus af SAMP, anvendtes i denne undersøgelse.
HMSCs var isoleret og udvidet i laboratorium fra knoglemarv (BM) prøver fra normal, uidentificerede donorer efter informeret samtykke ved hjælp af validerede og tidligere offentliggjorte protokoller15,16. Efter isolering og ekspansion, MSC evne i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic differentiering blev evalueret i laboratoriet af flere assays15. Den osteogenic funktionel analyse blev udført af implanterer keramiske terninger af hydroxyapatit/tricalciumphosphat fosfat matrix indeholdende hMSCs subkutant i immunkompromitterede CB17-Prkdc SCID mus17. Cube analysen viser osteogenesis og chondrogenesis potentielle og betragtes som den ultimative test til at vurdere individuelle MSC præparater17. For at visualisere hMSCs i vivo efter injektion, blev lentivirus brugt til at transduce hMSCs med tredobbelt reporter gen konstruktion, der består af firefly luciferase (fl), monomere rødt fluorescerende proteiner (mRFP) og herpes simplex viral thymidine kinase (ttk ), drevet af en modificeret myeloproliferative sarkom virus (mnd) promotor18. Firefly luciferase i tredobbelt reporter er et enzym der dækfjer injiceres luciferin til oxyluciferin i hMSCs og producerer fotoner/hvidt lys. Dette registreres af følsomme charge – sammen enhed (CCD) kamera (bioluminescens) i en i vivo optisk tænkelig ordning, muliggører visualisering af levende hMSCs i mus. Bioluminescens imaging (BLI) er en følsom teknik, der kan bruges seriefremstillede til sporing af celler og for ex vivo analyse. Brug af en stærk mnd promotor drev kontinuerlig udtryk for triple fusion reporter gen konstruktion og giver mulighed for billeddannelse af injicerede hMSCs for mere end 16 uger19. HMSCs er vanskeligt at transduce og har en lav transduktion effektivitet. Bruger en optimeret protokol, hMSCs transduktion effektivitet er blevet forbedret og transgen udtryk blev udvidet18. Ved hjælp af mRFP udtryk, (en af generne, tredobbelt reporter) på flowcytometri, blev evnen til at transduce hMSCs med en høj virkningsgrad på op til 83% demonstreret. Differentiering assays og i vivo cube assays demonstreret den transduced hMSCs evne til at differentiere i chondrocytter, adipocytter og osteocytes17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse beskriver en ny teknik for ultralyd-styrede intracardiac injektion af hMSCs i en lille-tarm musemodel af eksperimenterende CD. Denne teknik har meget høj sats for overlevelse og succes, som bane af nålen kan justeres baseret på real-time, høj opløsning billeder af musen venstre hjertekammer, leveret af ultralyd. Fordelen ved levering til venstre hjertekammer er, at hMSCs fordeles derefter intra-arterially og omgå venøs cirkulation, således at man undgår sammenlægning af cellerne i lungerne. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave understøttes af Department of Defense grant PR141774 og Crohns og Colitis Foundation of America karriere udvikling Award. Laboratoriet af Fabio Cominelli understøttes af NIH tilskud DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) og DK07948 (FC). Laboratoriet for Arnold Caplan er delvist understøttet af L. David og E. Virginia Baldwin Foundation. De finansielle organer spillede ingen rolle i undersøgelse analyse eller skrivning af manuskriptet. Dens indhold er udelukkende ansvarlig for forfatterne.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
