Guidée par échographie intracardiaque Injection des cellules souches mésenchymateuses d’augmenter le retour vers l’intestin pour une utilisation dans des modèles murins de maladies intestinales inflammatoires expérimentale
Summary
Murines études sur des modèles d’inflammation du côlon ont montré qu’un faible pourcentage (1-5 %) des cellules souches mésenchymateuses (CSM) injecté par voie intraveineuse ou par voie intrapéritonéale à domicile à l’inflammation du côlon1,2. Cette étude montre que guidée par échographie intracardiaques injections de MSCs entraîner localisation accrue à l’intestin.
Abstract
Maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique commune du petit et du gros intestin. Murins et humains cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel immunosuppresseur et auraient dû être divulgués pour supprimer l’inflammation dans les modèles murins d’inflammation intestinale, même si la voie d’administration peut limiter leur homing et efficacité 1 , 3 , 4 , 5. application locale de MSCs aux modèles de lésion colique a montré une efficacité supérieure à atténuer l’inflammation du côlon. Cependant, il y a peu de données sur les techniques pour améliorer la localisation de MSCs de moelle osseuse humaines (CSM) à l’intestin grêle, le site de l’inflammation dans le modèle de SAMP-1/YitFc (SAMP) maladie de Crohn expérimentale. Cet ouvrage décrit une nouvelle technique d’injection intracardiaque guidée par échographie de CSM chez les souris de la SAMP, un modèle bien caractérisé spontané de l’inflammation intestinale chronique. Sexe – et appariés selon l’âge, les souris AKR/J (AKR) exempte d’inflammation ont été utilisés comme témoins. Pour analyser la biodistribution et la localisation, les CSM ont été transduites avec un lentivirus contenant un journaliste triple. Le journaliste triple se composait de la luciférase firefly (fl), pour l’imagerie bioluminescente ; protéine fluorescente rouge monomérique (RDRF), pour le tri des cellules ; et tronquée de l’herpès simplex virus thymidine kinase (ttk), pour l’imagerie par émission de positrons (TEP). Les résultats de cette étude montrent que 24 h après l’administration intracardiaque, CSM localiser dans l’intestin des souris SAMP par opposition à exempte d’inflammation des souris AKR. Ce roman, injection guidée par ultrason du CSM dans le ventricule gauche de souris SAMP assure un taux de réussite élevé de livraison de cellule, permettant la récupération rapide des souris avec une mortalité et une morbidité minime. Cette technique pourrait être une méthode utile pour la localisation accrue de MSCs dans d’autres modèles d’inflammation intestinale grêle, tels que TNFΔRE,6. Les études à venir détermineront si la localisation accrue du CSM par voie intra-artérielle peut conduire à une augmentation efficacité thérapeutique.
Introduction
Maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique commune du petit et du gros intestin et est probablement le résultat d’une réponse inappropriée du système immunitaire hôte à microbes intestinaux7,8. Des études récentes ont montré que les murins et humains cellules souches mésenchymateuses (CSM) peut supprimer l’inflammation dans les modèles murins d’inflammation intestinale1,3,4,5. Il y a plusieurs essais cliniques en cours qui utilisent MSCs humaines dérivées de la moelle osseuse ou du tissu adipeux pour traiter les patients atteints de maladie intestinale inflammatoire (MII), qui comprend le CD9. Deux itinéraires pour la thérapie de la CSM ont été utilisées dans ces essais cliniques : l’un implique la perfusion systémique (c.-à-d., par voie intraveineuse) de MSCs pour EIA luminale (y compris les CD) et l’autre consiste en l’application localisée/injection de cellules souches dans la fistule tract de patients avec CD périanale. Dans une récente méta-analyse de thérapie MSC pour EIA, systémique (c.-à-d., par voie intraveineuse) thérapie MSC pour EIA luminale (y compris les CD) a été efficace chez jusqu’à 40 % (IC à 95 % : 7-79 %) des patients, alors que l’efficacité était beaucoup plus élevée, à 61 % ([IC95 : : 36-85 %), quand les MSCs ont été injectés localement à la malade de fistule CD9. Multicentrique récente phase III randomisée contrôlée contre placebo d’allogéniques cellules souches adipeuses injecté directement dans la fistule périanale de CD patients a montré des preuves cliniques et radiologiques statistiquement significative des fistules périanales, guérison, corroborant les résultats de la méta-analyse de10. Les raisons de la faible efficacité de la thérapie MSC administrée par voie intraveineuse pour CD luminal a été suffisamment examinés, mais une des raisons est peut-être le homing inadéquat de MSCs sur le site de l’inflammation. Murines études sur des modèles d’inflammation du côlon ont montré que seulement un faible pourcentage de MSCs (1-5 %) injecté par voie intraveineuse atteignent le côlon enflammé ; les MSCs restants sont filtrées par les poumons (effet de premier passage)1,2 ,5,11,12. Plusieurs études de recherche murins ont donc utilisé la voie intrapéritonéale (i.p.) pour l’administration de MSC dans les modèles animaux de colite4. Cependant, ils ont également démontré que seulement une petite fraction des cellules atteignent et greffer le côlon et que l’efficacité est liée à la sécrétion de facteurs solubles paracrine, comme des gènes inductibles par le facteur de nécrose tumorale 6 protéines (STG-6)2. Le mécanisme MSC de l’immunosuppression et la guérison implique une approche multiforme qui implique paracrine ; facteurs de proximité indépendant de cellules, comme STG-6 ; facteurs de proximité-dépendante, de la cellule comme programmé mort-ligand 1 (PD-L1) ; ou en escalier 1. Donc, localisation MSC sur le site de l’inflammation peut entraîner une augmentation efficacité9,13. En effet, une étude récente montre que MSCs directement implantés à l’endroit de la blessure du côlon dans la guérison en sécrétant l’angiogenèse favorisant vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF). En revanche, un effet minime de guérison a été noté après injection intraveineuse de5. Pour augmenter leur localisation sur le site de l’inflammation (c.-à-d., l’intestin grêle chez les souris SAMP), cette technique d’injection intracardiaque guidée par échographie pour l’administration de MSC dans le ventricule gauche a été développée. Guidée par l’image injection assure une injection précise, ce qui conduit à un taux de réussite supérieur à diminué le taux de mortalité et de morbidité. Par ailleurs, l’injection de MSCs dans le ventricule gauche remet à la circulation artérielle, où ils peuvent atteindre l’intestin enflammé avant de devenir emprisonné dans les poumons.
Dans cette étude, MSCs de moelle osseuse humaines (CSM) ont été utilisées pour l’injection dans le modèle murin de SAMP-1/YitFc (SAMP) du CD14. SAMP est un modèle murin spontané bien caractérisé d’inflammation chronique qui développe l’inflammation intestinale-petit avec presque 100 % de pénétrance14. L’inflammation se développe en réponse à la microflore en l’absence de toute manipulation génétique, immunologique ou chimique et ressemble à humain CD11. Souris de la AKR/J (AKR) inflammation-free Sex – et appariés selon l’âge, les souris contrôle parental du SAMP, ont été utilisées dans cette étude.
Le CSM ont été isolés et élargi en laboratoire des échantillons de moelle osseuse (BM) provenant de donneurs normaux, non identifiés après que consentement éclairé à l’aide de validé et publié précédemment protocoles15,16. Après isolement et l’expansion, la capacité MSC en ostéogénique, adipocytaire, et différenciation chondrogéniques a été évaluée en laboratoire par plusieurs essais sur15. Le test fonctionnel ostéogénique a été réalisé par l’implantation des cubes en céramique d’une matrice hydroxyapatite/tricalcium phosphate contenant du CSM par voie sous-cutanée dans les sujets immunodéprimés de souris SCID CB17-Prkdc17. Le test de cube montre ostéogenèse et chondrogenèse potentiels et est considéré comme l’ultime épreuve d’évaluation individuelle MSC préparations17. Pour visualiser le CSM en vivo après l’injection, les lentivirus servait à transduce CSM avec construction de gène de journaliste triple qui se compose de la luciférase firefly (fl), protéine fluorescente rouge monomérique (RDRF) et l’herpès simplex thymidine kinase virale (ttk ), conduit par un sarcome myéloprolifératifs mis à jour le virus (mnd) promoteur18. La luciférase firefly dans le journaliste triple est une enzyme que luciférine injecté tectrices à oxyluciferin au CSM et produit des photons/blanc bleu. Ceci est détecté par la caméra sensible dispositif à couplage de charge (CCD) (bioluminescence) dans in vivo d’imagerie système, qui permet la visualisation du CSM direct chez la souris optique. Bioluminescence imaging (BLI) est une technique sensible qui peut être utilisée en série pour le suivi des cellules et pour l’analyse des ex vivo . L’utilisation d’un promoteur fort MINISTERIELLE entraîne l’expression continue de la construction de gène de journaliste triple fusion et permet l’imagerie des CSM injectée pendant plus de 16 semaines19. Le CSM est difficiles à transmettre et ont un rendement faible de transduction. En utilisant un protocole optimisé, l’efficacité de la transduction du CSM a été améliorée et l’expression du transgène a été renforcée18. À l’aide d’expression RDRF (un des gènes journaliste triple) sur la cytométrie en flux, la capacité à transmettre le CSM à rendement élevé jusqu’à 83 % a été démontrée. Différenciation des essais et des essais in vivo cube démontré la capacité de la CSM transduite à se différencier en chondrocytes, les adipocytes et les ostéocytes,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude décrit une nouvelle technique d’injection intracardiaque guidée par échographie de CSM dans un modèle de souris petit digestif de CD expérimental. Cette technique a un taux très élevé de survie et le succès, que la trajectoire de l’aiguille peut être réglée selon les images haute résolution en temps réel du ventricule gauche souris, fournies par l’échographie. L’avantage de la livraison pour le ventricule gauche est que CSM est ensuite distribuées intra-artériellement et contourner l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave est pris en charge par ministère de la défense grant PR141774 et la maladie de Crohn et la colite Foundation d’Amérique Career Development Award. Le laboratoire de Fabio Cominelli est pris en charge par les NIH accorde DK042191 (C.F.), DK055812 (C.F.), DK091222 (C.F.) et DK07948 (C.F.). Le laboratoire de Arnold Caplan est soutenu en partie par le L. David et E. la Virginie Baudouin Foundation. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’analyse de l’étude ou écriture du manuscrit. Son contenu est la seule responsabilité des auteurs.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
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