הזרקת Intracardiac מונחה אולטרה סאונד של גזע Mesenchymal האנושי כדי להגדיל את יונת אל המעי לשימוש במודלים מאתר של מחלות מעי דלקתיות ניסיוני
Summary
מאתר מחקרים במודלים של דלקת המעי הגס הראו כי אחוז קטן (1-5%) של גזע mesenchymal (MSC) מוזרק לווריד או intraperitoneally הביתה כדי מודלק colon1,2. מחקר זה מראה כי זריקות intracardiac מונחה אולטרה סאונד של MSCs לגרום בלוקליזציה מוגברת אל המעי.
Abstract
מחלת קרוהן (CD) היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה קטן המעי הגס. מאתר ואנושי בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יש פוטנציאל לדיכוי המערכת החיסונית, הוכחו לדכא דלקת במודלים של העכבר של דלקת מעיים, אף-על-פי התוואי של המינהל יכול להגביל את יונת ואת האפקטיביות 1 , 3 , 4 , 5. יישום מקומי של MSCs למודלים פציעה שטיפת המעי הגס הראו להתייעלות ב ameliorating דלקת במעי הגס. עם זאת, יש במחסור של נתונים על טכניקות לשיפור הלוקליזציה של האדם הנגזרות מח עצם MSCs (hMSCs) אל המעי הדק, האתר של דלקת במודל SAMP-1/YitFc (SAMP) של קרוהן ניסיוני. עבודה זו מתארת טכניקה חדשנית עבור הזרקה intracardiac מונחה אולטרה סאונד של hMSCs בעכברים SAMP, מודל ספונטנית מאופיין היטב של דלקת מעיים כרונית. סקס – ואת גיל-מתאימים, עכברים AKR/J (AKR) ללא דלקת שימשו פקדים. כדי לנתח את biodistribution ואת ההתאמה, hMSCs היו transduced עם lentivirus המכילה כתב משולשת. הכתב טריפל כללה גחלילית לוציפראז (פל), עבור הדמיה מייצרים אור; monomeric אדום חלבון פלואורסצנטי (mrfp), למיון תא; קטום הרפס וירוס תימידין קינאז (ttk), עבור הדמיה טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET). התוצאות של מחקר זה מראים הזה 24 שעות לאחר מתן של intracardiac, hMSCs לשפה במעי הדק של SAMP עכברים לעומת עכברים AKR ללא דלקת. הרומן מונחה אולטרה סאונד הזרקה של hMSCs החדר השמאלי של SAMP עכברים מבטיח שיעור הצלחה גבוה המסירה תאים, ומאפשר התאוששות מהירה של עכברים עם מינימלי התחלואה והתמותה. טכניקה זו יכולה להיות שיטה שימושית עבור ההתאמה משופרת של MSCs במודלים אחרים של דלקת קטנה-מעיים, כגון TNFΔRE6. מחקרים עתידיים יקבע אם לוקליזציה מוגברת של hMSCs על ידי משלוח התוך עורקי יכול להוביל יעילות טיפולית מוגברת.
Introduction
מחלת קרוהן (CD) היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה קטן המעי הגס ונחשב כתוצאה מענה לא הולם של מערכת החיסון המארחת החיידקים במעיים7,8. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מאתר והן אנושית בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יכול לדכא דלקת במודלים של העכבר של דלקת מעיים1,3,4,5. ישנם ניסויים קליניים מתמשך מרובות המשתמשות MSCs האנושי שמקורם במח העצם או רקמת שומן לטיפול בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר כוללת תקליטור9. שני מסלולים לטיפול MSC שומש בניסויים קליניים אלה: אחד כרוך החדרת מערכתית (קרי, דרך הווריד) של MSCs עבור luminal מחלת המעי הדלקתי (כולל תקליטור), והשני כולל היישום מקומי/ההזרקה של תאי גזע בפיסטולה מערכת של חולים עם perianal CD. ב האחרונה מטא אנליזה של MSC. טיפול מחלת המעי הדלקתי, מערכתית (קרי, תוך ורידי) MSC. טיפול luminal מחלת המעי הדלקתי (כולל תקליטור) היה יעיל ב- 40% (95% CI: 7-79%) של חולים, ואילו היעילות גבוהה בהרבה, 61% (95% CI: 36-85%), כאשר MSCs היו מוזרק באופן מקומי פיסטולה CD חולה9. Multicenter השלישי שלב זה התבצעה מבוקר פלסבו ניסוי של תאי גזע allogeneic אדיפוז מוזרק ישירות לתוך פיסטולה perianal של תקליטור חולים הראו משמעותי סטטיסטית ראיות קליני, רדיולוגית fistulae perianal ריפוי, אקראי מאמתים את ממצאי מטא אנליזה10. הסיבות יעילות נמוכה של טיפול MSC דרך הווריד לתקליטור luminal נחקר כראוי, אבל אחת הסיבות עשויה להיות יונת לקוי של MSCs לאתר של דלקת. מאתר מחקרים במודלים של דלקת המעי הגס הראו כי רק אחוז קטן של MSCs (1-5%) מוזרק לווריד להגיע המעי הגס מודלק; MSCs הנותרים מסוננים על ידי הריאות (אפקט כניסה ראשונה)1,2 ,5,11,12. מספר מחקרים מאתר ולכן השתמשו המסלול בקרום הבטן (i.p.) עבור ניהול MSC במודלים חייתיים של קוליטיס4. עם זאת, גם הדגים כי רק חלק קטן של תאים להגיע engraft המעי הגס ואת זה היעילות הקשורים ההפרשה של גורמים paracrine מסיסים, כמו גידול נקרוזה מקדם-inducible ג’ין 6 חלבונים (TSG-6)2. MSC מנגנון החיסוני וריפוי כרוך בגישה multipronged המערבת paracrine; גורמים קרבה תלויית התא, כמו TSG-6; ותא גורמים תלויי-קרבה, כמו מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1); או 1 משוננים. לכן, לוקליזציה MSC לאתר של דלקת עלולה לגרום יעילות מוגברת9,13. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי MSCs מושתל ישירות באתר של פציעה שטיפת המעי הגס גרמו ריפוי על ידי הפרשת אנגיוגנזה קידום כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF). מצד שני, אפקט ריפוי מינימלית צוין לאחר הזרקה תוך ורידי5. כדי להגדיל לוקליזציה שלהם לאתר של דלקת (קרי, המעי הדק בעכברים SAMP), פותחה טכניקה זו מונחה אולטרה סאונד הזרקת intracardiac לניהול MSC החדר השמאלי. הזרקת תמונה מונחה מבטיחה הזרקה מדויקת, אשר מוביל אל שיעור גבוה יותר של הצלחה, כדי ירדו התחלואה ואת התמותה. יתר על כן, ההזרקה של MSCs לתוך החדר השמאלי מספק להם הדם העורקי, שבו הם יכולים להגיע המעי הדק מודלק לפני הופך להיות לכוד בתוך הריאות.
במחקר זה, האדם הנגזרות מח עצם MSCs (hMSCs) שימשו הזרקת במודל SAMP-1/YitFc (SAMP) מאתר של CD14. SAMP הוא מודל מאופיין היטב מאתר ספונטנית של דלקת כרונית אשר מפתחת דלקת מעיים-קטן עם כמעט 100% penetrance14. הדלקת מתפתחת בתגובה microflora, בהעדר כל מניפולציה כימית, אימונולוגי או גנטי, הדומה CD האנושי11. סקס – ואת גיל-מתאימים ללא דלקת AKR/J (AKR) עכברים, העכברים בקרת הורים של SAMP, השתמשו במחקר זה.
HMSCs היו מבודדים והתרחבה במעבדה של דגימות מח עצם (מוניטור) שהושג מתורמים נורמלי, לא מזוהה, לאחר הסכמה מדעת באמצעות לאמת ופורסמו בעבר פרוטוקולים15,16. לאחר בידוד, הרחבה, היכולת MSC adipogenic osteogenic, בתוך, בידול chondrogenic היה מלווה במעבדה ע י מבחני מספר15. וזמינותו פונקציונלי osteogenic בוצע על ידי השתלת קוביות קרמיקה של היידרוקסיאפטיט/tricalcium פוספט מטריצה המכילה hMSCs subcutaneously ב CB17-Prkdc SCID immunocompromised עכברים17. קוביית וזמינותו מדגים פרכת ו chondrogenesis פוטנציאליים ונחשב במבחן האולטימטיבי להערכת MSC בודדים ההכנות17. כדי להמחיש hMSCs ויוו לאחר ההזרקה, lentivirus שימש מגלי hMSCs עם הבונה ג’ין כתב טריפל המורכב גחלילית לוציפראז (פל), חלבון פלואורסצנטי אדום monomeric (mRFP) ו הרפס ויראלי תימידין קינאז (ttk ), מונע על ידי יזם וירוס (mnd)18ששונה myeloproliferative סרקומה. גחלילית לוציפראז ב הכתב משולש הוא אנזים luciferin מוזרק את coverts כדי oxyluciferin ב hMSCs ומייצרת פוטונים/לבן אור. זה מזוהה על ידי המצלמה רגיש תשלום מצמידים מכשיר (CCD) (ביולומינסנציה) ויוו אופטי מערכת, המאפשר את החזיית בשידור חי hMSCs בעכברים הדמיה. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) היא טכניקה רגיש יכול לשמש באופן סדרתי עבור מעקב אחר תאים ו- ex-vivo לניתוח. השימוש של מקדם mnd חזקה כוננים הביטוי רציפה של פיוז’ן טריפל כתב ג’ין הבונה ומאפשר ההדמיה של hMSCs מוזרק עבור יותר מ 16 שבועות19. HMSCs קשים מגלי ויש של יעילות נמוכה התמרה חושית. באמצעות פרוטוקול ממוטבת, היעילות התמרה חושית hMSCs היה משופר, הביטוי transgene היה משופר18. באמצעות ביטוי mRFP (אחד הגנים כתב טריפל) cytometry זרימה, הדגימו את היכולת מגלי hMSCs עם יעילות גבוהה של עד 83%. מבחני בידול, ויוו קוביה מבחני הפגינו את היכולת של hMSCs transduced להבדיל לתוך chondrocytes, adipocytes ו- osteocytes17.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מתאר טכניקה חדשנית עבור הזרקה intracardiac מונחה אולטרה סאונד של hMSCs במודל של עכברים קטנים-מעיים של תקליטור ניסיוני. טכניקה זו יש שיעור גבוה מאוד של הישרדות והצלחה, גם המסלול של המחט ניתן להתאים בהתבסס על תמונות בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה של החדר העכבר השמאלי, שסופקו על-ידי. האולטרסאונד. הי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
דייב מאניש נתמך על ידי מענק ההגנה PR141774 ואת קרוהן קוליטיס כיבית של אמריקה הקריירה פיתוח פרס. המעבדה של פאביו Cominelli נתמך על-ידי NIH מעניקה DK042191 (עירוני), DK055812 (עירוני), DK091222 (עירוני), DK07948 (עירוני). המעבדה של ארנולד קפלן נתמך בחלקה על ידי דוד ל’ וקרן בולדווין אי וירג’יניה. סוכנויות מימון היה אין תפקיד מחקר ניתוח או הכתיבה של כתב היד. התוכן שלה הם אחריות הכותבים.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
