Ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av humana mesenkymala stamceller att öka Homing till tarmen för användning i murina modeller av experimentella inflammatoriska tarmsjukdomar
Summary
Murina studier i modeller av kolon inflammation har visat att en liten andel (1-5%) av mesenkymala stamceller (MSC) injiceras intravenöst eller intraperitonealt hem till den inflammera kolon1,2. Denna studie visar att ultraljud-guidad intrakardiellt injektioner av MSCs resultera i ökad lokalisering till tarmen.
Abstract
Crohns sjukdom (CD) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom i små och stora tarmar. Murina och mänsklig mesenkymala stamceller (MSC) har immunsuppressiva potentialen och har visat att undertrycka inflammation i musmodeller av tarminflammation, även om administreringsvägen kan begränsa deras homing och effektivitet 1 , 3 , 4 , 5. lokala tillämpningen av MSCs kolon skada modeller har visat större effekt på ameliorating inflammation i tjocktarmen. Det finns dock bristen på uppgifter om tekniker för att förbättra localizationen av mänsklig benmärg-derived MSCs (hMSCs) till tunntarmen, platsen för inflammation i SAMP-1/YitFc (SAMP) modellen av experimentella Crohns sjukdom. Detta arbete beskriver en ny teknik för ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs i SAMP möss, en välkarakteriserad spontana modell av kronisk tarminflammation. Sex – och åldersmatchade, inflammation-fri AKR/J (AKR) möss användes som kontroller. För att analysera biodistribution och lokaliseringen, var hMSCs sensorik med ett lentivirus som innehåller en trippel reporter. Trippel reportern bestod av firefly luciferas (fl), för självlysande avbildning; monomer röd fluorescerande protein (mrfp), för cell sortering; och trunkerade herpes simplex virus tymidinkinas (ttk), för positronemissionstomografi (PET) imaging. Resultaten av denna studie visar att 24 h efter intrakardiellt kan hMSCs lokalisera i tunntarmen av SAMP möss i motsats till inflammation-fri AKR möss. Denna roman, ultraljud-guidad injektion av hMSCs i vänster kammare av SAMP möss säkerställer en hög framgång på cell leverans, vilket möjliggör snabb indrivning av möss med minimal sjuklighet och dödlighet. Denna teknik kan vara en användbar metod för förbättrad lokalisering av MSCs i andra modeller av små-intestinal inflammation, till exempel TNFΔRE6. Framtida studier kommer att avgöra om ökad lokalisering av hMSCs av Intra-arteriell leverans kan leda till ökad terapeutisk effekt.
Introduction
Crohns sjukdom (CD) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom i små och stora tarmar och är tänkt att resultera från ett olämpligt svar värd immunsystemet till intestinala mikroberna7,8. Nyligen genomförda studier har visat att både murina och mänsklig mesenkymala stamceller (MSC) kan dämpa inflammation i musmodeller av tarminflammation1,3,4,5. I området i närheten finns det flera pågående kliniska prövningar som använder mänskliga MSCs härrör från benmärgen eller fettvävnad för att behandla patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), vilket inkluderar CD9. Två vägar för MSC terapi har använts i dessa kliniska prövningar: en involverar systemisk infusionen (dvs, intravenöst) av MSCs för luminala IBD (inklusive CD), och den andra innebär lokaliserade ansökan/injektion av stamceller i fistel tarmkanalen hos patienter med perianal CD. I en nyligen meta-analys av MSC terapi för IBD, systemisk (dvs. intravenös) MSC terapi för luminala IBD (inklusive CD) var effektiv i upp till 40% (95% CI: 7-79%) av patienterna, medan effekten var mycket högre, på 61% (95% CI: 36-85%), när MSCs skulle injiceras lokalt i den sjuka CD fistel9. En senaste fas III multicenter randomiserad placebo-kontrollerad studie av allogena fett stamceller injiceras direkt i perianal fistel CD patienter visade statistiskt signifikanta kliniska och radiologiska tecken på perianala fistlar healing, bekräftar resultaten av en metaanalys10. Skälen till den låga effekten av MSC terapi ges intravenöst för luminala CD har studerats otillräckligt, men en anledning kan vara de otillräckliga homing av MSCs till platsen för inflammation. Murina studier i modeller av kolon inflammation har visat att de återstående MSCs filtreras av lungorna (första-passage-effekten)1,2 bara en liten andel av MSCs (1-5%) injiceras intravenöst nå inflammerade tjocktarmen; ,5,11,12. Flera murina forskningsstudier har därför använt sträckan intraperitoneal (IP) för MSC administration i djurmodeller av kolit4. De har emellertid också visat att endast en bråkdel av celler nå och engraft tjocktarmen och att effekten är relaterat till utsöndringen av lösliga parakrin faktorer, såsom tumörnekrosfaktor-inducerbara gen 6 protein (GTS-6)2. MSC mekanismen av immunsuppression och läkning innebär en öppen strategi som involverar parakrin; cell närhet-oberoende faktorer, som GTS-6; och cell närhet-beroende faktorer, liksom programmerad död-ligand 1 (PD-L1); eller ojämna 1. Därför, MSC lokalisering till platsen av inflammation kan resultera i ökad effekt9,13. I själva verket visade en nyligen genomförd studie att MSCs direkt implanteras på platsen för kolon skada resulterade i helande genom att utsöndra angiogenes-främja vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Däremot, noterades en minimal läkande effekt efter intravenös injektion5. För att öka deras localization till platsen av inflammation (dvs. tunntarmen i SAMP möss), utvecklades detta ultraljud-guidad intrakardiellt injektionsteknik för MSC administration i vänster kammare. Bild-guidad injektion säkerställer en korrekt injektion, vilket leder till en högre frekvens av framgång och till minskad sjuklighet och dödlighet. Dessutom levererar en injektion av MSCs i vänster kammare dem till arteriell cirkulation, där de kan nå inflammerade tunntarmen innan att bli instängd i lungorna.
I denna studie användes mänsklig benmärg-derived MSCs (hMSCs) injektionsvätska i SAMP-1/YitFc (SAMP) murina modellen CD14. SAMP är en välkarakteriserad spontana murina modell av kronisk inflammation som utvecklar små-tarminflammation med nästan 100% penetrans14. Inflammation utvecklar svar på mikrofloran i avsaknad av någon kemisk, immunologiska eller genetisk manipulation och liknar mänskliga CD11. Sex – och åldersmatchade inflammation-fri AKR/J (AKR) möss, föräldrakontroll möss av SAMP, användes i denna studie.
HMSCs var isolerade och expanderat i laboratoriet från benmärgen (BM) produktproverna normal, oidentifierade givare efter informerat samtycke använda validerats och tidigare publicerade protokoll15,16. Efter isolering och expansion, MSC förmågan i osteogent, adipogena, och chondrogenic differentiering utvärderades i laboratorium av flera analyser15. Osteogena funktionella analysen utfördes av implantera keramiska kuber av hydroxyapatit/trikalciumfosfat fosfat matris som innehåller hMSCs subkutant i nedsatt immunförsvar CB17-Prkdc SCID möss17. Kub analysen visar osteogenesis och kondrogenes potentiella och anses vara det ultimata testet för att utvärdera enskilda MSC preparat17. För att visualisera hMSCs i vivo efter injektion, användes lentivirus för att transduce hMSCs med trippel reporter gen konstruktion som består av firefly luciferas (fl), monomer röd fluorescerande protein (mRFP) och herpes simplex virus tymidinkinas (ttk ), driven av en modifierad myeloproliferativa sarkom virus (mnd) arrangören18. Den firefly luciferas i trippel reportern är ett enzym som gömslen injicerade luciferin till oxyluciferin i hMSCs och producerar fotoner/vitt ljus. Detta upptäcks av känsliga kostnad – tillsammans enhet (CCD) kameran (Mareld) i en in-vivo optisk imaging system, som gör att visualisering av levande hMSCs i möss. Mareld imaging (BLI) är en känslig teknik som kan användas seriellt för att spåra celler och för ex vivo analys. Användning av en stark mnd promotor driver kontinuerlig uttrycket av den tredubbla fusion reporter gen bygga och möjliggör avbildning av injicerade hMSCs i mer än 16 veckor19. HMSCs är svåra att transduce och har en låg transduktion effektivitet. Med en optimerad protokollet, hMSCs transduktion effektiviteten förbättrades och transgenens uttryck var förbättrad18. Använder mRFP uttryck (en av generna som trippel reporter) på flödescytometri, visades förmågan att transduce hMSCs med en hög verkningsgrad på upp till 83%. Differentiering-analyser och i vivo kub analyser visat den transduced hMSCs förmåga att differentieras till kondrocyter, adipocyter och osteocyter17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie beskriver en ny teknik för ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs i en liten-tarm musmodell av experimentella CD. Denna teknik har mycket hög överlevnad och framgång, som banan för nålen kan justeras baserat på realtid, högupplösta bilder av musen vänster kammare, som tillhandahålls av Ultraljudet. Fördelen med leverans till vänster kammare är att hMSCs distribueras inom arterially och kringgå venösa cirkulationen, därmed undvika sammanläggning av celler i lungorna. Tidigare anv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave stöds försvarsdepartementet grant PR141774 och Crohns kolit Foundation of America karriär utveckling Award. Laboratoriet för Fabio Cominelli stöds av NIH beviljar DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) och DK07948 (FC). Laboratoriet för Arnold Caplan stöds delvis av L. David och E. Virginia Baldwin stiftelse. Finansiärerna hade ingen roll i studien analys eller skrivandet av manuskriptet. Dess innehåll ansvarar enbart för författarna.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
