Summary

Ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon bağırsak için giriş için deneysel iltihabi bağırsak hastalıkları fare modellerinde kullanım artırmak için insan Mezenkimal Kök hücre

Published: September 01, 2017
doi:

Summary

Fare modelleri kolon iltihabı çalışmalarda Mezenkimal Kök hücre (MSC) küçük bir yüzdesi (% 1-5) intravenöz enjekte veya intraperitoneally iltihaplı kolon1,2için ev gösterdi. Bu çalışmada ultrason destekli MSCs İntrakardiyak enjeksiyonlari bağırsak için artan yerelleştirme neden gösterir.

Abstract

Crohn hastalığı (CD) ortak bir kronik inflamatuar hastalık küçük ve büyük bağırsak var. Fare ve insan Mezenkimal Kök hücre (MSCs) immünsupresif potansiyele sahip ve yönetim rotanın kendi posta ve etkinliği 1 sınırlayabilirsiniz olsa bile iltihap bağırsak iltihabı, fare modelleri bastırmak için gösterilmiş olan , 3 , 4 , 5. yerel MSCs uygulamaya kolon yaralanma modelleri kolon iltihabı ameliorating, daha fazla etkinlik göstermiştir. Ancak, veri üstünde insan kemik iliği türevi MSCs (hMSCs) ince bağırsak iltihabı deneysel Crohn hastalığı, SAMP-1/YitFc (SAMP) modeli sitesi için yerelleştirme geliştirmek için teknik yetersizliği vardır. Bu eser hMSCs kronik bağırsak iltihabı iyi karakterize spontan modeli SAMP farelerde ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon için yeni bir teknik anlatılmaktadır. Cinsiyet ve yaş-eşlemeli, inflamasyon-Alerjik AKR/J (AKR) fare denetimleri kullanılmıştır. Biodistribution ve yerelleştirme çözümlemek için hMSCs üç kişilik bir muhabir içeren bir lentivirus ile transduced. Üçlü muhabir ateş böceği luciferase (fl), kollarındaki görüntüleme için oluşuyordu; hücre sıralama için monomeric kırmızı floresan protein (mrfp); ve kesilmiş herpes simpleks virüs timidin kinaz (ttk), Pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme. Bu çalışmanın sonuçları bu 24 h İntrakardiyak yönetim sonra ince bağırsak iltihabı-Alerjik AKR fareler aksine SAMP farelerin hMSCs yerelleştirmek göster. Bu roman, ultrason destekli enjeksiyon SAMP fare sol ventrikül hMSCs yüksek başarı oranı hücre teslimat, minimal morbidite ve mortalite ile fare hızlı kurtarma için izin sağlar. Bu teknik MSCs gelişmiş yerelleştirme TNFΔRE6gibi küçük bağırsak iltihabı diğer modelleri için yararlı bir yöntem olabilir. Gelecekteki çalışmalar hMSCs içi Arteryel teslim tarafından artan lokalizasyonu için artan tedavi edici etkinliği yol açabilir Eğer belirleyecektir.

Introduction

Crohn hastalığı (CD) ortak bir kronik inflamatuar hastalık küçük ve büyük bağırsak ve ana bilgisayar bağışıklık sisteminin uygunsuz bir yanıt bağırsak mikropları7,8‘ e neden olarak düşündüm. Son yıllarda yapılan çalışmalarda fare ve insan Mezenkimal Kök hücre (MSCs) iltihabı bağırsak iltihabı1,3,4,5fare modellerinde önleyebilirsiniz göstermiştir. İnsan MSCs kemik iliği veya yağ dokusu türetilmiş CD9içerir (IBD), iltihabi bağırsak hastalığı olan hastalarda tedavi kullanmak birden fazla devam eden klinik çalışmalar vardır. MSC tedavisi için iki güzergah bu klinik çalışmalarda kullanılan: bir sistemik infüzyon içerir (Yani, intravenöz) MSCs luminal IBD (CD dahil) ve diğer, yerelleştirilmiş uygulama/enjeksiyon fistül kök hücrelerin içerir perianal CD hastalarda yolu. Bir son meta-analiz IBD, sistemik için MSC tedavisinin (Yani, intravenöz) luminal IBD (CD dahil) için MSC terapi içinde % 40 kadar etkili (% 95 GA: 7-%79) hastaların, etkinliği % 61 daha yüksek ise (% 95 CI: 36-%85), ne zaman MSCs Yerel olarak hastalıklı CD fistül9içine enjekte edildi. Son aşama III multicenter allojeneik yağ kök hücrelerin doğrudan CD hastalar şifa perianal fistüllere istatistiksel olarak anlamlı klinik ve radyolojik kanıt gösterdi perianal fistül enjekte plasebo kontrollü randomize, meta-analiz10bulguları corroborating. MSC terapi intravenöz luminal CD için verilen düşük etkinliği nedenlerle yeterli ölçüde araştırdık ama MSCs yetersiz posta inflamasyon siteye nedenlerinden biri olabilir. Fare modelleri kolon iltihabı çalışmalarda intravenöz enjekte MSCs (% 1-5) küçük bir yüzdesi ulaşmak sadece iltihaplı kolon; kalan MSCs akciğer (ilk geçiş etkisi)1ile,2 süzülür göstermiştir ,5,11,12. Birden çok fare araştırma çalışmaları bu nedenle MSC İdaresi kulunç4hayvan modellerinde mayi rota (IP) kullanılmaktadır. Ancak, onlar da sadece hücreleri küçük bir kısmını ulaşmak ve iki nokta üst üste engraft ve etkinliği olduğunu tümör nekrozis faktör-indüklenebilir gen 6 protein gibi çözünebilir parakrin faktörler salgılanmasını (TSG-6)2ile ilgili olduğunu gösterdi. MSC mekanizması immünosupresyon ve iyileşme parakrin içerir bir multipronged yaklaşım içerir; TSG-6 gibi hücre yakınlık bağımsız faktörler; ve gibi yakın bağlı faktörler, hücre ölüm-ligand 1 (PD-L1); programlanmış ya da pürüzlü 1. Bu nedenle, siteye MSC yerelleştirilmesini iltihap artan etkinliği9,13‘ te neden olabilir. Aslında, yeni yapılan bir çalışmada kolon yaralanma sitesinde doğrudan implante MSCs angiogenez teşvik vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) salgılayan tarafından iyileşmesinde sonuçlandı gösterdi. Öte yandan, en az bir iyileştirici etkisi sonra intravenöz enjeksiyon5belirtilmişti. Siteye kendi yerelleştirme inflamasyon (Yani, bağırsakta SAMP fareler) artırmak için sol ventrikül yönetiminde yüksek lisans için bu İntrakardiyak enjeksiyon ultrason destekli teknik geliştirilmiştir. Görüntü güdümlü enjeksiyon daha yüksek oranda başarı için yol açar ve morbidite ve mortalite oranları azalmıştır doğru bir enjeksiyon sağlar. Ayrıca, sol ventrikül içine MSCs enjeksiyon onları arteriyel dolaşımı, onlar iltihaplı bağırsak küçük ciğerlerine olma önce ulaşabilecekleri teslim eder.

Bu çalışmada, insan kemik iliği türevi MSCs (hMSCs) enjeksiyon CD14, SAMP-1/YitFc (SAMP) fare modeli için kullanılmıştır. SAMP bir iyi karakterize spontan fare ile neredeyse % 100 alellerle14küçük bağırsak iltihabı geliştirir kronik inflamasyon modeldir. İltihap yanıt mikrofloranın yokluğunda, herhangi bir kimyasal, immünolojik ve genetik manipülasyon olarak geliştirir ve çok benzeyen insan CD11. AKR/J (AKR) fareler, inflamasyon-Alerjik, SAMP, ebeveyn kontrolü fareler cinsiyet ve yaş bahisler bu çalışmada kullanılmıştır.

HMSCs izole ve aydınlatılmış onam kullanılarak doğrulanır ve önceden protokolleri15,16yayınlanan normal, kimliği belirsiz bağış elde edilen kemik iliği (BM) örneklerinden laboratuvarda genişletilmiş. Yalıtım ve genişleme, MSC yetenek sonra içinde Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma birden çok deneyleri15tarafından laboratuvar olarak değerlendirilmesi. Osteojenik fonksiyonel tahlil hidroksiapatit/TRİKALSİYUM fosfat matris hMSCs subkutan olarak immün CB17-Prkdc SCID fareler17içeren seramik küpler Reproduction tarafından gerçekleştirildi. Küp tahlil osteogenesis ve chondrogenesis potansiyel gösterir ve bireysel MSC ürünleri17değerlendirmek için nihai test olarak kabul edilir. HMSCs in vivo enjeksiyon sonra görselleştirmek için lentivirus hMSCs ateş böceği luciferase (fl), monomeric kırmızı floresan protein (mRFP) ve herpes simpleks viral timidin kinaz (ttk oluşan üç kişilik muhabir gen yapısı ile transduce için kullanılan ), bir değiştirilmiş miyoproliferatif sarkomu virüs (Tümen) organizatörü18tarafından tahrik. Ateş böceği luciferase üçlü muhabir olarak o örtü enjekte biyoluminesans hMSCs oxyluciferin için bir enzimdir ve fotonlar/beyaz ışık üretir. Bu bir vivo içinde görüntüleme sistemi, canlı hMSCs farelerde görselleştirme etkinleştirme optik hassas şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera (bioluminescence) tarafından algılanır. (BLI) görüntüleme bioluminescence seri olarak hücreleri izleme ve ex vivo analiz için kullanılabilecek hassas bir tekniktir. Güçlü tümen organizatörü kullanımı üçlü füzyon muhabir gen yapısı sürekli ifade ediyor ve enjekte hMSCs görüntüleme için daha–dan 16 hafta19sağlar. HMSCs transduce ve düşük iletim verimliliği var zordur. En iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralını kullanarak, hMSCs iletim verimliliği geliştirildi ve gelişmiş18transgene ifade edildi. MRFP ifade (bir üçlü reporter genler) Akış Sitometresi üzerinde kullanarak, hMSCs % 83’e varan yüksek bir verimlilik ile transduce yeteneği gösterilmiştir. Farklılaşma deneyleri ve in vivo küp deneyleri kondrosit, adipositler ve osteocytes17ayırt etmek için transduced hMSCs yeteneğini gösterdi.

Protocol

tüm fareler deneyler ve yordamlar çalışma Case Western Reserve Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ' s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Yordamlar Derneği değerlendirmesi için yapılmıştır ve laboratuvar hayvan bakımı (AAALAC) akreditasyonu tesis akredite. Aydınlatılmış onam sonra üniversite hastaneleri kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanan Protokolü Case Western Reserve Üniversitesi, kök hücre çekirdeği tesisinde altında BM Aspire. 1. K?…

Representative Results

Şekil 1 hMSCs kök hücre özelliklerini koruyarak üçlü muhabir ile yüksek verimlilikle transduced olduğunu gösterir. Transduced hMSCs (şekil 1 c, şekil 3) BLI tarafından gerçek zamanlı olarak görüntülenmeyecektir. Bu roman, SAMP fare sol ventrikül içine hMSCs ultrason destekli enjeksiyon enjeksiyon, minimal morbidite ve mortalite (Şekil 2) ile fare hı…

Discussion

Bu çalışmada ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon hMSCs deneysel CD, küçük bağırsak fare modeli için yeni bir teknik anlatılmaktadır. İğne yörünge fare sol ventrikül ultrason tarafından sağlanan, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleri dayalı ayarlanabilir gibi bu teknik başarı, ve hayatta kalma çok yüksek oranına sahiptir. Sol ventrikül teslim hMSCs sonra intra arterially dağıtılır ve böylece hücre akciğerlerde toplama kaçınarak Venöz dolaşım bypass avantaj…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Maneesh Dave savunma grant PR141774 ve Crohn ve kolit Vakfı Amerika kariyer geliştirme Ödülü tarafından desteklenir. Fabio Cominelli laboratuvar NIH tarafından desteklenen DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) ve DK07948 (FC) verir. Arnold Caplan laboratuvar kısmen L. David ve E. Virginia Baldwin Vakfı tarafından desteklenmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma çözümleme veya yazma makalenin herhangi bir rolü yoktu. İçeriği sadece yazarların sorumluluğunda.

Materials

DMEM-LG   Gibco 31600-091
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25-200-072
Proteamine Sulfate Sigma Aldrich P4020-1G
D-Luciferin Goldbio luck-500
Fetal Bobine Serum Gibco 26140-079
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
PBS HyClone SH30256.01
175 cm tissue cutlure flasks Corning 431080
75 cm tissue cutlure flasks Corning 430720
Centrifuge tubes Crysalgen 23-2265
Tissue-Plus O.C.T. compound Fisher HealthCare 4585
Cryomold Standard Tissue-Tek  4557
Lenti-Pac HIV Expression Packaging System GeneCopoeia HPK-LvTR-20 
Povidone Ionidine swabs Medline MDS093901
Hair removal cream Nair N/A
Isoflurane  Piramal Helathcare  NDC 66794 013 25
Forceps  Fine Science Tools 11200-33
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Puralube vet ointment Puralube NDC 17033-211-38
Aquasonic 100 ultrasound transmission gel Parker laboratories 01 08
Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
SAMP mice Cleveland Digestive Disease Research Core Centre
AKR mice Cleveland Digestive Disease Research Core Centre
Vevo 770 imaging system  Visual Sonics, Toronto, Canada
 IVIS spectrum series system  PerkinElmer, Waltham, MA
Living image software  CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
Triple reporter Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19)

References

  1. Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
  2. Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
  3. Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
  4. Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
  5. Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
  6. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  7. Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
  8. Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
  9. Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
  10. Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
  13. English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
  16. Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
  17. Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
  18. Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
  19. Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
  20. Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
  21. Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
  22. Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
  23. Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
  24. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
check_url/kr/55367?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Dave, M., Menghini, P., Sugi, K., Somoza, R. A., Lee, Z., Jain, M., Caplan, A., Cominelli, F. Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases. J. Vis. Exp. (127), e55367, doi:10.3791/55367 (2017).

View Video