Quantificazione assoluta di A?_1-42 In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Summary

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introduction

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo ^1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau ² e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi ³ aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD ^4. Per misurazioni CSF di Ap _1-42, vari test immunologici sono disponibili e sono utilizzati in molti laboratori clinici ^5. La concentrazione di Ap _1-42 in CSF è inferiore di circa il 50% in pazienti con AD rispetto al cognitivo normale anziani, riflettendo la deposizione del peptide in placche nel brain ^{6, 7.}

Questi biomarcatori sono principalmente analizzati utilizzando saggi immunologici (ad esempio, le tecniche a base di anticorpi), ma questi test possono essere influenzati da effetti di matrice ^8. L'uso di saggi immunologici su piattaforme tecnologiche diverse e la mancanza di test di standardizzazione ^{9, 10} rende l'introduzione di concentrazioni di cut-off globali difficili ^{11, 12.} Un RMP analiticamente convalidato avrebbe permesso la calibrazione uniforme delle piattaforme di analisi diverse, idealmente con conseguente migliore comparabilità tra le piattaforme di analisi e in un migliore controllo dei fattori che contribuiscono alla variabilità complessiva di misura.

La quantificazione assoluta di Ap _1-42 con il metodo LC-MS / MS sviluppata supera molti dei problemi connessi con tecn a base di anticorpiiques. Il metodo, indicato come un RMP dal comitato misto per la tracciabilità in Medicina di Laboratorio (JCTLM archivio di identificazione numero C11RMP9), sarà utilizzato per determinare la concentrazione assoluta di Ap _1-42 in un materiale di riferimento certificato (CRM) per armonizzare CSF Ap ₁ misurazioni _-42 attraverso tecniche e piattaforme analitiche. Il flusso di lavoro descritto deve essere rilevante per lo sviluppo di metodi di riferimento candidato per peptidi e proteine ​​all'interno di altre aree della medicina.

Protocol

NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C. Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza. 1. preparazione delle soluzioni Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca co…

Representative Results

Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti. Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di qua…

Discussion

Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita ^{13, 14, 15, 16,} che consente la calibrazione in CSF umano. L'approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro ⁽¹³ CA?…

Materials

Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000