En Voorbereiding van Muis Bloedvaten
Summary
Een procedure voor het maken van een gezichtspreparatie van de muizencarotisarterie en aorta wordt beschreven. Dergelijke preparaten, wanneer immunofluorescent gekleurd met specifieke antilichamen, ons in staat stellen om lokalisatie van eiwitten en identificatie van celtypen in de gehele vaatwand door confocale microscopie te bestuderen.
Abstract
Afdelingen van paraffine ingebedde weefsels worden routinematig gebruikt voor het bestuderen van weefselhistologie en histopathologie. Het is echter moeilijk om te bepalen wat de driedimensionale weefselmorfologie uit dergelijke secties is. Daarnaast kunnen de onderzochte secties van de weefsels niet het gebied bevatten in het weefsel dat nodig is voor het lopende onderzoek. Deze laatste beperking belemmert histopathologische studies van bloedvaten, aangezien vasculaire laesies op een gefocuste manier ontwikkelen. Dit vereist een methode waarmee we een breed gebied van de bloedvatmuur kunnen onderzoeken, van het oppervlak naar de diepe gebieden. Een volledige voorbereiding van de bloedvaten voldoet aan deze eis. In dit artikel zullen we aantonen hoe u een gezichtspreparatie van de muis aorta en halsslagader maakt en immunofluorescente ze voor confocale microscopie en andere soorten fluorescentie gebaseerde beeldvorming kunt vinken.
Introduction
Voor histopathologische studies door middel van lichtmicroscopie worden drie-dimensionale stukjes biologische weefsels routinematig verwerkt voor paraffine-inbedding, gevolgd door doorsneden en kleuring. Een weefselmonster die paraffine-ingebed is, kan in alle drie de afmetingen meerdere millimeter zijn. Voor de lichtmicroscopie moet het eerst eerst worden gesneden zodat het licht door kan gaan en vervolgens wordt gekleurd zodat het dunne gedeelte voldoende contrast biedt voor afbeelden. Omdat gesneden specimens meestal 5-10 μm dik zijn, ziet men slechts een kleine deel van het hele monster in twee dimensies tegelijk. Het is mogelijk om opeenvolgende secties te verzamelen en, na het afbeelden van elke sectie afzonderlijk, computerondersteunde reconstructie van de 3D-beelden uit te voeren, maar dit is inderdaad een vervelende baan. Histopathologie van bloedvaten, vooral voor het bestuderen van de pathogenese van atherosclerose, biedt unieke problemen. Atherosclerose is een geconcentreerde ziekte die zich ontwikkeltLokaal in gebieden waar verstoorde bloedstroom optreedt. Bovendien wordt de ziekte geïnitieerd binnen de intima, een dun weefsel dat bestaat uit een monolaag van endotheelcellen en extracellulaire matrix, van grote slagaders. Om deze redenen is het een uitdaging om vroege letsels te lokaliseren en te bestuderen met behulp van doorsnede bloedvaten, omdat men de lesion gemakkelijk kan missen. Zelfs als een sectie een ziek gebied omvat, ziet men slechts een 5-10 μm portie dat endotheelcellen en andere vaatwandcellen bevat in de media en adventitia.
Met complete voorbereiding van een gezicht (uitgesproken en fäs) kunnen we een breed oppervlak van het bloedvatoppervlak onderzoeken, zoals de hele aorta van de aortische wortel helemaal naar beneden naar de gewone hartslagaders. Door gebruik te maken van een dergelijk specimen gebleekt met specifieke antilichamen en andere specifieke probes, kan men de locatie van letsels bepalen en ook waar verschillende moleculaire gebeurtenissen zich voordoen in endotheelcellen in combinatie met wiDe atherogenese zoals veranderingen in de expressie, lokalisatie en posttranslational modificaties van eiwitten. Naast het bestuderen van atherogenese wordt de endotheliale celvorm waargenomen in een gezichtspreparatie gebruikt als een indicator van het regionale tijdgemiddelde bloedstroompatroon. Dergelijke gegevens zijn belangrijk voor het bestuderen van mechanische signalering van endotheelcellen in situ. Voor dit doel zijn routine histologische dwarsdoorsnede bloedvaten niet bruikbaar. Zo is het voor vasculaire geneeskunde en biologie bijzonder belangrijk om een techniek te verkrijgen voor het maken van een gezichtspreparatie van bloedvaten waarmee men een breed gebied van het vaatoppervlak evenals de diepere ondergronds van het vat kan waarnemen.
Zoals door Jelev en Surchev 1 beoordeeld, hebben vasculaire biologen verschillende methoden ontwikkeld om de voering van bloedvaten en gezicht te waarnemen. Enkele ingenieuze methoden werden ontwikkeld in de jaren 1940 en 1950. Met behulp van deze methoden waren ze In staat zijn om de fundamentele organisatie van endotheelcellen die het inwendige oppervlak van de bloedvaten regelen te bestuderen. Vanwege de wijze waarop deze en-gezichtspreparaten worden voorbereid (de zogenaamde Hautchen methode 2 , 3 , 4 of afscheiding van het vaatoppervlak 5 ) en de manier waarop het monster werd gekleurd, was het niet altijd mogelijk om ononderbroken morfologische Informatie van het vaartuigoppervlak in de dieper gebieden van de bloedvatmuur. Voorbereiding van de volledige berg- en gezichtsbehandeling gecombineerd met immunofluorescentievervuiling liet ons toe om niet alleen de endotheliale celmorfologie en eiwituitdrukking en lokalisatie in deze cellen te bestuderen, maar ook dergelijke studies uit te breiden naar het subendotheliale gebied van de vatwand. Vroege studies met behulp van bloedvaten en gezichtspreparaten werden in de jaren '80 van 6 tot en met 19 gebleken immunoflures verschenen .F "> 7. Met de komst van laserscanning-confocale microscopie en recentere multiphoton-microscopie, kan men nu in-focusbeelden van de bloedvatwandstructuur verkrijgen in immunofluorescent gekleurde en gezichtsvatenmonsters, evenals het vaatnetwerk in levende dieren 8 , 9 , 10 , 11. Deze computergebaseerde beeldtechnieken creëren optische doorsnedebeelden in focus, en bij het opmaken van dergelijke beelden kan men gereconstrueerde 3D-beelden van de vaatwand en het vaatnetwerk in weefsels verkrijgen. Kan beelden genereren van een sectie die langs de Z-as van de gereconstrueerde afbeelding 12 , 13 is gemaakt .
In dit artikel zullen we een methode illustreren voor het voorbereiden van gezichtspreparaten van de muis aorta en de halsslagader voor immunofluorescente kleuring. En gezichtspreparatenKan worden gemaakt, zelfs nadat deze vaten experimenteel zijn gemanipuleerd. Bijvoorbeeld kan een carotis-arterie gedeeltelijk geligeerd worden en dan een een-gezichtsbereiding gemaakt na een dergelijke operatie. Om deze reden zullen we in dit artikel ook beschrijven hoe we een gedeeltelijke ligatie op de halsslagader doen. Vergeleken met het maken van soortgelijke preparaten van grotere dieren, zoals ratten, konijnen en mensen, zijn muisvaten klein van grootte en fragiel, waardoor er extra zorg nodig is om te behandelen tijdens chirurgische isolatie van vaten en ze voor te bereiden op antilichamen kleuring en microscopie. Omdat het meest gebruikte diermodel voor genetische modificatie de muis is, wordt het van groot belang dat veel onderzoekers muisvaten hanteren zonder ze te beschadigen. In dit manuscript beschrijven we hoe u de bloedvaten van de muis moet behandelen bij het maken van een gezichtspreparatie van de aorta en de hartslagader. Voor de demonstratie zullen we wildtype C57 / b6 muizen gebruiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het hanteren van muisbloedvaten is het belangrijk om te onthouden dat het endothelium breekbaar is en dat een overmatige mechanische kracht endothelcellen zal beschadigen. Bijvoorbeeld, de endotheelcellen breken of losmaken van de vaatwand als het vat te krachtig wordt geperfueerd, wat gemakkelijk kan gebeuren wanneer de vaatwasser wordt geperfuseerd met een handbediende spuit.
Om constante perfusiedruk te verkrijgen, gebruiken we een zwaartekracht perfusie systeem met een druk van 120 c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De onderzoeksactiviteiten van de auteurs worden ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Gezondheid aan Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
