En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Summary

É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.

Abstract

As secções de tecidos embebidos em parafina são rotineiramente utilizadas para estudar histologia de tecido e histopatologia. No entanto, é difícil determinar qual é a morfologia tridimensional do tecido a partir dessas seções. Além disso, as secções dos tecidos examinados podem não conter a região dentro do tecido que é necessária para a finalidade do estudo em curso. Esta última limitação dificulta estudos histopatológicos de vasos sanguíneos uma vez que as lesões vasculares se desenvolvem de forma focalizada. Isto requer um método que nos permita examinar uma vasta área da parede dos vasos sanguíneos, desde a sua superfície até regiões mais profundas. Uma montagem completa en face preparação dos vasos sanguíneos cumpre este requisito. Neste artigo, vamos demonstrar como fazer preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida e imunofluorescentemente mancha-los para microscopia confocal e outros tipos de imagem baseada em fluorescência.

Introduction

Para estudos histopatológicos por microscopia óptica, tridimensional partes de tecidos biológicos são rotineiramente processados ​​para parafina embedment seguido de seccionamento e coloração. Uma amostra de tecido que foi embebida em parafina pode ter vários milímetros em todas as três dimensões. No entanto, para a finalidade da microscopia de luz, deve ser primeiro seccionado de modo que a luz possa atravessar e manchada então de modo que a seção fina rendesse o suficiente contraste para a imagem latente. Porque os espécimes seccionados são geralmente 5-10 μm na espessura, um vê somente uma fração muito pequena do espécime inteiro em duas dimensões de cada vez. É possível coletar seções seqüenciais e, após a imagem de cada seção individualmente, realizar reconstrução assistida por computador das imagens 3D, mas este é um trabalho tedioso. Histopatologia dos vasos sanguíneos, especialmente para o estudo da patogênese da aterosclerose, apresenta problemas únicos. A aterosclerose é uma doença focalizada que desenvolveLocalmente em áreas onde ocorre o fluxo sanguíneo perturbado. Além disso, a doença é iniciada dentro da íntima, um tecido fino constituído por uma monocamada de células endoteliais e matriz extracelular, de grandes artérias. Por estas razões, é um desafio para localizar e estudar lesões precoces usando vasos sanguíneos seccionados, porque pode-se facilmente deixar de seccionar a lesão. Mesmo se uma secção incluir uma área doente, ver-se-á apenas uma porção de 5-10 μm contendo células endoteliais e outras células da parede vascular nos meios e adventitia.

Preparações completas de montagem em face (pronunciadas än fäs) nos permitem examinar uma vasta área da superfície do vaso sanguíneo, como a aorta inteira da raiz da aorta, até as artérias ilíacas comuns. Utilizando um tal espécime corado com anticorpos específicos e outras sondas específicas, pode-se identificar a localização das lesões e também onde ocorrem vários eventos moleculares em células endoteliais em conjunção comA aterogénese, tais como alterações na expressão, localização e modificações pós-traducionais de proteínas. Além de estudar a aterogênese, a forma de célula endotelial observada em preparações faciais é usada como um indicador do padrão regional de fluxo sanguíneo em tempo médio. Tais dados são importantes para o estudo da cicatrização mecânica de células endoteliais in situ. Para esta finalidade, os vasos sanguíneos histológicos transversais de corte não são úteis. Assim, para medicina vascular e biologia, é especialmente importante adquirir uma técnica para fazer preparações en face de vasos sanguíneos que permite observar uma vasta área da superfície do vaso, bem como as áreas mais profundas subsuperfície do vaso.

Conforme revisto por Jelev e Surchev ¹ , os biólogos vasculares desenvolveram vários métodos para observar o revestimento dos vasos sanguíneos em face. Alguns métodos engenhosos foram desenvolvidos nos anos 1940 e 1950. Usando esses métodos, eles foram Capaz de estudar a organização fundamental das células endoteliais que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. No entanto, devido ao modo como estas preparações em face são preparadas (o chamado método de Hautchen ^{2 , 3 , 4} ou descascamento da superfície do recipiente ⁵ ) e a forma como o espécime foi corado, nem sempre foi possível obter uma morfologia morfológica ininterrupta Informações da superfície do vaso para as áreas mais profundas da parede dos vasos sanguíneos. A preparação de vasos en-face de montagem completa combinada com a coloração por imunofluorescência permitiu não apenas estudar a morfologia das células endoteliais ea expressão e localização das proteínas nessas células, mas também estender esses estudos à região subendotelial da parede do vaso. Os primeiros estudos usando vasos sanguíneos en face preparações imunoflurescently manchadas começaram a aparecer na década de 1980 ^{6 ,}7. Com o advento da microscopia confocal de varrimento a laser e, mais recentemente, a microscopia multifotónica, pode-se agora obter imagens nítidas claras da estrutura da parede dos vasos sanguíneos em amostras de vasos en face imunofluorescentemente corados bem como a rede vascular em animais vivos ^{8 , 9 , 10 , 11.} Estas técnicas de imagem baseadas em computador criam imagens seccionadas ópticas em foco e, empilhando-as, podem obter-se imagens 3D reconstruídas da parede vascular e da rede vascular nos tecidos. Pode gerar imagens de uma secção feita ao longo do eixo Z da imagem reconstruída ^{12 , 13} .

Neste artigo, iremos ilustrar um método para preparar preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida para a coloração imunof luorescente. En face preparaçõesPode ser feita mesmo depois destes vasos terem sido experimentalmente manipulados. Por exemplo, uma artéria carótida pode ser ligada parcialmente e depois uma preparação en face preparada após tal cirurgia. Por esta razão, também descreveremos neste artigo como realizamos uma ligadura parcial na artéria carótida. Comparados com preparações semelhantes de animais maiores tais como ratos, coelhos e seres humanos, os vasos de ratinho são de pequeno tamanho e mais frágeis, necessitando assim de cuidados adicionais durante o isolamento cirúrgico dos vasos e preparando-os para a coloração de anticorpos e a microscopia. Como o modelo animal mais comumente usado para a modificação genética é o mouse, torna-se crítico para muitos pesquisadores lidar com vasos de mouse sem danificá-los. Neste manuscrito, vamos descrever como lidar com os vasos sanguíneos do rato quando se fazem preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida. Para efeitos de demonstração, utilizaremos ratinhos C57 / b6 de tipo selvagem.

Protocol

Os protocolos para a ligadura da artéria carótida parcial do mouse e o isolamento da aorta do rato e da artéria carótida para a imunocoloração de face são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IBT 2014-9231). 1. Ligação da Artéria Carótida Parcial Esquerda Prepare o espaço cirúrgico, colocando uma almofada de aquecimento de 12 polegadas x 14 polegadas sobre a mesa e cobrir a almofada e tampo da mesa com um grande drapeado cirúrgico limpo….

Representative Results

Uma imagem de imunofluorescência em face típica do endotélio é mostrada na Figura 3 . Esta imagem mostra uma única secção óptica de uma aorta do rato tomada perto da abertura de uma artéria intercostal (a grande área escura em forma de ovo). A aorta foi duplamente corada com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1) (vermelho). Cada célula endotelial é delineada com uma coloração linear verde na junção dos aderentes….

Discussion

Ao manusear os vasos sanguíneos do rato, é importante lembrar que o endotélio é frágil e que qualquer força mecânica excessiva danificará as células endoteliais. Por exemplo, as células endoteliais quebram ou se desprendem da parede do vaso se o vaso é perfundido com muita força, o que pode acontecer facilmente quando a vasculatura é perfundida usando uma seringa operada manualmente.

Para obter uma pressão de perfusão constante, utilizamos um sistema de perfusão por gravidade…

Materials

0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2×2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000