Биолюминесценция Визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после инокуляции периферической альфа-синуклеина фибрилл
Summary
Периферийные инъекции альфа-синуклеина фибрилл в брюшину или языком Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей, которые экспрессируют человеческий альфа-синуклеина с наследственной мутации A53T и люциферазы светлячка, может вызвать невропатологии, в том числе нейровоспаления , в их центральной нервной системе.
Abstract
Для изучения прионов, как поведение неправильно свернутых альфа-синуклеина, мышиные модели необходимы, что позволяет быстро и просто передавать альфа-синуклеина prionoids, которые вызывают невропатологии в пределах центральной нервной системы (ЦНС). Здесь мы описываем , что intraglossal или внутрибрюшинную инъекцию альфа-синуклеина фибрилл в bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей, которым гиперэкспрессией человеческий альфа-синуклеина с мутацией A53T от промотора прионного белка и люциферазы светлячка из промотор для глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP), является достаточным , чтобы вызвать заболевание нейропатологического. По сравнению с гомозиготной Tg (M83 + / +) мышей , которые развиваются тяжелые неврологические симптомы , начиная в возрасте 8 месяцев, гетерозиготных Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) животные остаются свободными от спонтанного заболевания , пока они не достигнут возраст 22 месяцев. Интересно, что инъекция альфа-синуклеина фибрилл через intraperitoneаль маршрут индуцированное неврологическое заболевание с параличами в четырех из пяти Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей со средним временем инкубации 229 ± 17 дней. Пораженные животные показали серьезные отложения фосфорилированного альфа-синуклеина в мозге и спинном мозге. Скопление альфа-синуклеин было саркозили-нерастворимым и локализуется с убиквитиным и p62, и сопровождался воспалительной реакция, в результате чего астроцитов глиоза и microgliosis. Удивительно, но инокуляция альфа-синуклеина фибрилл в язык был менее эффективен в возникновении болезни только с одним из пяти инъецированных животных с альфа-синуклеина патологии после 285 дней. Наши результаты показывают , что прививка через intraglossal маршрута и тем более через внутрибрюшинно подходит для индукции неврологического заболевания с соответствующим клеймом синуклеинопатий в Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. Это дает новую модель для изучения прионов-как патогенез индуцируютd с помощью альфа-синуклеина prionoids более подробно.
Introduction
Существует все больше доказательств того, что альфа-синуклеин имеет характеристики, которые аналогичны прионный белок, в частности, в его способности к самостоятельным семенам и распространяющихся неправильному фолдинг между клетками и вдоль нервными путями. Это свойство альфа-синуклеина также упоминается как «прионов типа» или «prionoid», и подтверждается наблюдениями в трансплантации экспериментов, которые предполагают трансмиссивности неправильно свернутых альфа-синуклеина из пораженных нейронов вновь пересаженные здоровые нейроны 1, 2 , 3, 4. Кроме того, прямая инъекция альфа-неправильно свернутых синуклеина в мозг или на периферии, например, мышцы задних конечностей или кишечной стенки, приводит к распространению альфа-синуклеина патологии в дистальных отделах ЦНС 5, 6, 7, <SUP класс = "Xref"> 8, 9, 10. Мы проанализировали передачу альфа-синуклеина prionoids через периферийных маршрутов более подробно рассмотрены на вопрос, может ли неправильно уложенный альфа-синуклеина neuroinvade ЦНС после однократного intraglossal или внутрибрюшинного введения, функцию, которая ранее была показана для прионов, но не для неправильно свернутых альфа- синуклеин. После инъекции прионов в язык, neuroinvasion ЦНС достигается с помощью распространения вдоль подъязычного нерва языка , что приводит к ядру подъязычного нерва, который расположен в стволе головного мозга 11. В мышиной модели мы выбрали Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей , которые сверхэкспрессируют A53T мутант человеческого альфа-синуклеина от промотора приона и люциферазы светлячка под контролем промотора GFAP астроцитов , чтобы контролировать активацию биолюминесценции, как ранее показано, в головном мозгеприон-инфицированных мышей 12. В наших руках bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей не развивается болезнь до 23 месяцев , как было показано , другие 13. Однократное введение альфа-синуклеина фибрилл человека через intraglossal или внутрибрюшинно индуцированных заболеваний неврологического с патологией в головном мозге и спинном мозге Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей , поддерживающих гипотезу о том, что альфа-синуклеина prionoids делиться важными характеристиками с прионов 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Периферийные инъекции альфа-синуклеина фибрилл в брюшину Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей представляет собой метод , легкое , чтобы вызвать неврологическое заболевание , сопровождающееся нейровоспаления резюмировать важные характеристики синуклеинопатий. Аналогичным образом, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Ольгу Шарма, Тереса Хандт, и персонал микроскопии и животных объектов DZNE для технической поддержки.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
