Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme
Summary
(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.
Abstract
yanlış katlı alfa-sinüklein prion benzeri bir davranış çalışma yapmak için, fare modelleri, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde nevropatlojinin neden olan alfa-sinüklein prionoids, hızlı ve basit bir iletimine izin verir ihtiyaç vardır. Farelerde, prion proteini promoterinden A53T mutasyonu ile insan alfa-sinükleinin aşırı ifade eden ve ateş böceği lusiferaz: Burada bigenic Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) içine alfa-sinüklein fibrillerinin bu intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyon tarif glial fibriller asidik protein promotörü (GFAP), nöropatolojik hastalık oluşturmak için yeterlidir. Hayvanların bir ulaşana kadar spontan hastalığı serbest kalır: 8 ay, heterozigot Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) bir yaşta başlayan şiddetli nörolojik semptomlar gelişebilir homozigot Tg (M83 + / +) fareler karşılaştırıldığında 22 ay yaşı. İlginç bir şekilde, intraperitone ile alfa-sinüklein fibrillerinin enjeksiyonu229 ± 17 günlük bir ortalama kuluçka süresi ile farelerde: el yol beş Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) dördünde felçli nörolojik hastalık kaynaklı. Hastalıklı hayvanların beyinleri ve omurilik fosforile alfa-sinüklein ciddi birikme gösterdi. alfa-sinüklein birikimleri sarkosil çözünmeyen ve ubikuitin ve P62 ile birlikte lokalize olduğunu ve astrositik gliyoz ve mikrogliyozu sonuçlanan bir enflamatuar tepki eşlik etti. Şaşırtıcı bir şekilde, dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin aşılama 285 gün sonra, alfa-sinüklein patolojiyi gösteren beş enjekte edilen hayvanların sadece bir tanesi ile hastalığa neden olan daha az etkili olmuştur. Bulgularımız (+/- M83: GFAP -Luc +/-) intraperitoneal yolla intraglossal rota ve daha çok yolu ile aşılama Tg sinükleinopatilerin ilgili işaretlerinden ile nörolojik hastalık ortaya çıkarmak için uygun olduğunu göstermektedir fareler. Bu neden prion-benzeri patojenezinin araştırılması için yeni bir model sağlardaha ayrıntılı olarak, alfa-sinüklein prionoids tarafından d.
Introduction
alfa-sinüklein özellikle kendinden tohuma sıfatıyla prion proteininin benzeyen ve hücreler arasındaki ve nöronal yollar boyunca yanlış katlanması yaymak özelliklere sahip olduğunu kanıtlar gittikçe artmaktadır. Alfa-sinüklein Bu özellik aynı zamanda 'prion-benzeri' ya da 'prionoid' olarak adlandırılır, ve yeni sağlıklı nöronlar 1, 2 nakledilen hastalıklı nöronlardan yanlış katlanmış alfa-sinüklein bulaşıcılığını göstermektedir nakli deneylerinde, gözlem ile desteklenmektedir , 3, 4. Ayrıca beyin veya çevresine, örneğin arka bacak, kas veya bağırsak duvarı, distal kısımlarına alfa-sinüklein patoloji yayılması ile sonuçlanır içine yanlış katlanmış alfa-sinüklein doğrudan enjeksiyon MSS 5, 6, 7, <sup sınıfı = "xref"> 8, 9, 10. Daha ayrıntılı olarak, periferik yollar ile alfa-sinüklein prionoids iletimini analiz edilmiş ve yanlış katlı alfa-sinüklein, tek intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyondan sonra daha önce prionlar için değil, yanlış katlanmış alfa- için gösterilmiş olan bir özellik merkezi sinir neuroinvade olup olmadığı sorusunu ele synuclein. Dillerine prionların enjeksiyonundan sonra, CNS neuroinvasion beyin sapı 11 bulunur hipoglosal sinir, çekirdeğine neden dilin hipoglosal sinir boyunca yayılımı ile elde edilir. Tarafından astrositik aktivasyon izleme prion promotöründen insan alfa-sinüklein A53T mutantını aşırı ifade eden, ve ateş böceği bir GFAP promotörünün kontrolü altında lusiferaz fareler: bir fare modelinde olarak, Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) seçtik biyoışıldama, daha önce beyinde de gösterildiği gibifareler 12 prion ile enfekte. Bizim ellerde bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) başkaları 13 tarafından gösterildiği gibi fareler yaşı 23 aya kadar hastalık olmadı. Beyinlerinde patolojisi ve Tg omurilik ile intraglossal ya da intraperitoneal yol kaynaklı nörolojik hastalık ile insan alfa-sinüklein fibrillerinin bir tek bir enjeksiyonu: hipotezi destekleyen farelerde (+/- M83 +/- GFAP -Luc) alfa-sinüklein prionoids prionların 14 ile önemli özellikleri paylaşır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) periton içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon farenin sinükleinopatilerin önemli özelliklerini özetlemek için nöro eşlik nörolojik hastalık oluşturmak için, basit bir yöntemi temsil eder. Benzer bir şekilde, dil enjeksiyon transgenik farelerde alfa-sinüklein prionoids ile neuroinvasion için başka bir yol tasvir eder fakat daha az etkilidir. Biz enjeksiyon sonrası 420 gün bizim deneyler sonlandırmak için seçti ve biz daha …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Olga Sharma, Theresa Hundt ve teknik destek için DZNE mikroskopi ve hayvan tesislerinin çalışanlarına teşekkür ederiz.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
