Summary
Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum of de tong van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine met familiaire A53T mutatie en vuurvlieg luciferase tot expressie brengen, kunnen neuropathologie induceren, waaronder neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel.
Abstract
De prion-achtige gedrag van verkeerd gevouwen alfa-synucleine bestuderen, zijn muismodellen nodig die snelle en eenvoudige overdracht van alfa-synucleïne prionoids die neuropathologie veroorzaken in het centrale zenuwstelsel (CZS) laten. Hier beschrijven we intraglossal of intraperitoneale injectie van alfa-synucleine fibrillen in bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine tot overexpressie met A53T mutatie van het prioneiwit promoter en vuurvlieg luciferase van de promotor voor glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), volstaat de neuropathologische ziekte induceren. In vergelijking met homozygote Tg (M83 + / +) muizen die ernstige neurologische symptomen beginnen op een leeftijd van 8 maanden, heterozygote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ontwikkelen dieren vrij blijven van spontane ziekte totdat ze een te bereiken leeftijd van 22 maanden. Interessant injectie van alfa-synucleine fibrillen via intraperitoneal route geïnduceerde neurologische ziekte met verlamming in vier van de vijf Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen met een gemiddelde incubatietijd van 229 ± 17 dagen. Zieke dieren vertoonden ernstige afzettingen van gefosforyleerde alfa-synucleine in hun hersenen en ruggenmerg. Ophopingen van alfa-synucleïne waren Sarkosyl onoplosbare en colocalized met ubiquitine en p62, onder begeleiding van een ontstekingsreactie resulteert in astrocytische gliose en microgliosis. Verrassenderwijs inoculatie van alfa-synucleine fibrillen in de tong minder effectief bij het veroorzaken van ziekte met slechts een van de vijf geïnjecteerde dieren met alpha-synuclein pathologie na 285 dagen. Onze bevindingen tonen aan dat enting via de intraglossal route en nog meer via de intraperitoneale route is geschikt voor neurologische ziekte met relevante kenmerken van synucleïnopathieën induceren in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. Dit zorgt voor een nieuw model voor het bestuderen van prion-achtige pathogenese inducerend door alfa-synucleine prionoids nader.
Introduction
Er is groeiend bewijs dat alfa-synucleine heeft kenmerken die lijken op die van het prion eiwit, met name in zijn vermogen om uitzaaien en propageren verkeerd vouwen tussen cellen en langs zenuwbanen. Deze eigenschap van alpha-synuclein wordt ook wel 'prion-achtige' of 'prionoid', en wordt ondersteund door waarnemingen bij transplantatie-experimenten, waarbij de overdraagbaarheid van verkeerd gevouwen alfa-synucleine van aangetaste neuronen suggereren nieuw getransplanteerde gezonde neuronen 1, 2 , 3, 4. Ook directe injectie van verkeerd gevouwen alfa-synucleïne in de hersenen of de periferie, zoals het achterbeen spier of darmwand leidt tot een spreiding van alpha-synuclein pathologie distale delen van het CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. We analyseerden overdracht van alfa-synucleine prionoids via perifere routes nader en de vraag of verkeerd gevouwen alpha-synuclein het CNS kan neuroinvade na één intraglossal of intraperitoneale injectie, een eigenschap die eerder was aangetoond voor prionen maar niet te verkeerd gevouwen alfa- geadresseerd synucleïne. Na injectie van prionen in de tong is neuroinvasion van het CZS bereikt door voortplanting langs de hypoglossale zenuw van de tong tot de kern van de hypoglossuszenuw, die is gelegen in de hersenstam 11. Als muismodel we kozen Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen die de A53T mutant van humaan alfa-synucleine van het prion promoter tot overexpressie brengen en vuurvlieg luciferase onder controle van een GFAP promotor astrocytaire activering door toezicht bioluminescentie, zoals eerder aangetoond in de hersenen vanprion-geïnfecteerde muizen 12. In onze handen bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) heeft muizen niet ontwikkelen van de ziekte tot 23 maanden oud, zoals is aangetoond door anderen 13. Een enkele injectie van humaan alfa-synucleine fibrillen via intraglossal of intraperitoneale route geïnduceerde neurologische ziekte pathologie in de hersenen en ruggenmerg van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen ondersteunt de hypothese dat alfa-synucleine prionoids deel belangrijke kenmerken met prionen 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van dieren werden uitgevoerd met toestemming van de dierenbescherming commissie van Noord-Rijnland-Westfalen State Environment Agency (LANUV). Dieren werden gehuisvest en verzorgd volgens standaardomstandigheden met een 12 uur licht / donkercyclus en vrije toegang tot voedsel en water.
1. Dierlijke Model
- Kruisen hemizygoot Tg (GFAP -Luc +/-) muizen met hemizygoot Tg (M83 +/-) muizen hemizygoot bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) genereren muizen 15, 16.
- Genotype nakomelingen met real-time PCR op de aanwezigheid van het transgen dat codeert voor humaan alfa-synucleine en met standaard PCR voor vuurvlieg luciferase 12, 17.
- Beënt de dieren op een leeftijd van zes tot acht weken.
2. Inoculumbereiding
- Bereid monomeric recombinant humaan alfa-synucleine de A53T mutatie in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer die 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) zoals eerder beschreven 14.
- Bereid fibrillaire alpha-synuclein voor inentingen door roeren 3 ug / ul monomeer recombinant humaan alfa-synucleine in een orbitale schudder bij 800 rpm en 37 ° C gedurende 5 dagen.
- Fibril verdunde samenstellingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1 ug / ul bereiken voor intraperitoneale of 2 ug / ul voor intraglossal inentingen.
- Fragment van de alfa-synucleine fibrillen met een staaf sonicator gedurende 1 min (40 pulsen met 0,5 seconden vertraging met één seconde pauze tussen de pulsen een amplitude ingesteld op 50%) op ijs. Om besmetting door cross-zaaien voorkomen. Gebruik schone sonicatie sondes naar verschillende inoculum te bereiden.
3. Intraglossal Injecties
- Verdoven dieren met intraperitoneal injectie van 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een goede verdoving te waarborgen. Gebruik dierenarts zalf op de ogen van het dier te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
- Fix genarcotiseerd dieren voorzichtig met plakband op een verwarmingsplaat in een dorsale liggende positie met hun hoofden gericht naar de onderzoeker.
- Vul een 27 G wegwerpbare injectiespuit met 5 pl gesoniceerde alfa-synucleine fibrillen of PBS.
- Met een stompe neus pincet met gekartelde uiteinden mond van het dier open te houden, en een kleinere pincet voorzichtig trek de tong aan de onderzijde van de tand toegankelijk voor injectie.
- Injecteer de naald van de injectiespuit in de rechter of linker onderzijde van de tand nabij de hypoglossale zenuw. Injecteer langzaam het inoculum na 5 s. Langzaam trekken de naald na 5 seconden zodat het inoculumheeft het weefsel doordrongen en niet verloren tijdens het terugtrekken van de naald.
- Laat het dier de fixaties en laat het op de verwarmingsplaat onder constante bewaking tot volledig herstel.
4. intraperitoneale injecties
- Voor intraperitoneale injecties, narcosemiddel dieren kort per anesthesie kamer door inhalatie van isofluraan / zuurstof onder toepassing van een stroomsnelheid van 2 l / min en ingesteld op 2% verdamper. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een goede verdoving te waarborgen.
- Vul een 27 G wegwerpbare injectiespuit met 50 ul van gesoniceerde alfa-synucleine fibrillen of PBS.
- Direct injecteren in het buikvlies van de muis en voorkomen penetreren van de dunne darm of blinde darm achter de buikwand door het houden van het dier in een dorsale positie met de kop afgekeerd van de onderzoeker en naar beneden ongeveer 45 °. Monitor dieren, totdat zij volledig zijn herstelduit de narcose.
5. Bioluminescentie Imaging
- Afbeelding Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen elke 2-4 weken met behulp van een bioluminescentie imaging-systeem.
- Vóór kort beeldvorming verdoven muizen per isofluraan / zuurstof kamer met een debiet van 2 l / min en ingesteld op 2% verdamper. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een goede verdoving te waarborgen.
- Scheren en ontharen de hoofden van de muizen met een ontharingscrème. Kleur de oren in het zwart met een niet-irriterend marker om niet-specifieke bioluminescentie te blokkeren.
- Verdunde D-luciferine kaliumzout, het substraat van luciferase in PBS tot 30 mg / ml voorraadoplossing. Sla deze in 1 ml porties bij -20 ° C. Bescherm de opgeloste D-luciferine tegen blootstelling aan licht.
- Weeg de dieren voorafgaand aan injectie. Bereken het exacte volume van D-luciferine voor injectie van 150 mg / kg lichaamsgewicht. Intraperitoneaal injecteren D-luciferin en geeft het dier aan de anesthesie kamer.
- Start de imaging software. Na de imaging-systeem heeft zijn bedrijfstemperatuur bereikt initialiseren van het systeem door te klikken op de 'Initialize' knop in het controlepaneel.
- Selecteer de knoppen 'lichtend' en 'Foto'. Stel de belichtingstijd tot 60 s, de binning op 'Medium', de F / Stop op '1', en de EM winst op 'Uit'.
- Controleer of de opwekkingsfilter op 'Block en de emissie filter 'Open' en stel de onderhavige hoogte tot 1,50 cm.
- Tien minuten na injectie van D-luciferine, plaatst de dieren op de verwarmingsplaat in de beeldvorming kamer en opdat de neuzen correct in de anesthesie uitlaat geplaatst. Sluit de isofluraan / zuurstof stroom uit de inhalatiekamer openen en de stroming van de beeldvorming kamer met een stroomsnelheid van 0,25 l / min en een verdamping van 2%. Sluit de deur van de afbeeldingskamer properly.
- Klik op de 'Acquire' om de bioluminescentie, waarvan 60 s duurt te meten. Stop de isofluraan stroom en toezicht op de dieren, totdat ze volledig zijn hersteld na zijn terugkeer ze terug naar hun kooien.
- Gebruik de imaging software om de bioluminescentie kwantificeren. Binnen de 'Tool Palette' te selecteren 'ROI Tools'. Onder 'Type' binnen de 'ROI Tools' selecteer 'Measurement ROI'.
- Binnen het 'ROI Tools' klikt u op de "cirkel" tool en selecteer het aantal ROI te trekken uit de pull-down menu - idealiter '3' voor drie muizen.
- In de afbeelding rechts op elke ROI onder 'Properties' stel de breedte en hoogte tot 1,25 cm. Plaats elk ROI over de hersenen gebied dat wordt gekwantificeerd.
- In de linkerbovenhoek van het beeld, stel de paneeleenheden op "straling (fotonen).
- Binnen de 'Tool Palette' de optie 'Beeld aanpassen' en stel de minimum- enhet maximum van de 'kleurenschaal', bijvoorbeeld van 0.20e6 tot 1.00e6.
- Onder 'Bestand' opslaan van de gegevens met 'Save'.
6. Biochemical Analysis
- Isoleer de hersenen en ruggenmerg volgens vastgestelde protocollen 18, 19.
- Homogeniseren volledige hersenen en ruggenmerg hele monsters afzonderlijk in PBS in aanwezigheid van protease en fosfatase remmers (verdund tot 1x in PBS) in twee 30 s cycli met 6000 rpm in een weefselhomogenisator. Zorgen dat de hersenen en het ruggenmerg monsters worden gehomogeniseerd tot een uiteindelijke concentratie van 20% (gew / vol).
- Ultrasone trillingen de monsters tweemaal terwijl hun plaatsing op ijs met een constante puls van 10 s en een amplitude ingesteld op 50%.
- Pas de homogenaten tot 10% in PBS en 750 mM NaCl door verdunning ze 1: 1 met 1,5 M NaCl in PBS.
- De celresten te scheiden, centrifuge de homogenaten bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij4 ° C. Houd de supernatanten voor de volgende stappen en gooi de pellets.
- Meet de eiwitconcentratie in de homogenaten met de bicinchoninezuur (BCA) bepaling volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer 1,0 mg totaal eiwit van homogenaat of 0,8 mg van het ruggenmerg homogenaten in N-laurylsarcosyl bij een uiteindelijke concentratie van 10% (gew / vol) gedurende 15 minuten op ijs.
- Overlay de homogenaten op een 3 ml sucrose kussen van 10% (gew / vol) in gedestilleerd water en ultracentrifuge ze bij 465.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellets in een buffer die 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 mM glycine, 25 mM Tris en 5% (gew / vol) sucrose.
- Kook de monsters bij 100 ° C gedurende 5 minuten en plaats ze op SDS-polyacrylamide gels elektroforese in een morfoline zuur (MES) buffersysteem.
- Overdracht van de gescheiden eiwitten op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen in een semiDry blotting systeem.
- Incubeer de membranen in 0,4% (vol / vol) oplossing van formaline in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotor met 35 rpm voor het verknopen van de eiwitten met het membraan.
- Blokkeren van de membranen in TBS buffer die 0,05% (vol / vol) Tween 20 en 5% (w / v) melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer de blots met het primaire antilichaam in blokkeringsbuffer gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Was de membranen drie keer in TBS buffer en incubeer ze met peroxidase of fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen in TBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Visualiseren het gebonden secundaire antilichamen door chemiluminescentie of fluorescentie volgens vastgestelde protocollen 20.
7. Immunofluorescentie analyse
- Dehydrateer de ontleed hersenen en ruggenmerg in een weefsel bewerkingsstation en insluiten in paraffine middels paraffine station.
- Snijd de paraffine ingebedde tisklaagt met een microtoom in 8 urn dikke coronale secties en monteren van de onderdelen op objectglaasjes.
- Deparaffinize de weefselcoupes door ze te incuberen in twee afzonderlijke baden xyleen gedurende 5-10 minuten en ze te rehydrateren door een reeks van gegradeerde ethanol baden (100%, 90%, 70%, 50%) en tenslotte met H2O
- Incubeer de secties in 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verder kook ze gedurende 10 minuten in een magnetron.
- Laat de secties afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze een 3% waterstofperoxide-oplossing gedurende 30 min endogene peroxidasen remmen.
- Blokkeer de weefselcoupes door incubatie met 20% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer de secties met het primaire antilichaam verdund in 1% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (v / v) BSA en 0,25% Triton X-100 in PBS overnacht bij 4 ° C. <li> Was de secties tweemaal met 0,25% (v / v) Triton X-100 in PBS en eenmaal met PBS.
- Vlekken op de profielen met de overeenkomstige fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen en het nucleaire kleurstof DAPI verdund in 1% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (vol / vol) BSA en PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Na tweemaal wassen met 0,25% (v / v) Triton X-100 in PBS en eenmaal met PBS, dekglaasje de dia's met inbedmassa en breng de kleuring met een confocale laser scanning microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perifere injectie van alfa-synucleïne prionoids via de tong of het buikvlies geïnduceerde neuropathologie in het CZS van bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen (Tabel 1 en Figuur 1). Na een enkele intraperitoneale injectie met alfa-synucleine fibrillen, vier van de vijf muizen ontwikkelden neurologische ziekte met een mediane incubatietijd van 229 ± 17 dagen. Verrassend is dat slechts een van de vijf muizen ontwikkelden CNS ziekte na intraglossal injectie met alfa-synucleine fibrillen na 285 dagen. Inenting met PBS geen ziekte te veroorzaken binnen de periode van 420 dagen van het experiment.
Biochemische analyse met Western blotting en probing met fosfo-specifiek antilichaam tegen EP1536Y Ser129 van alfa-synucleine gebleken dat voor beide transmissiewegen zieke dieren hadden gekregen aggregaten van gefosforyleerd en sarkosyl-insoluble alfa-synucleine in hun hersenen en ruggenmerg (tabel 2 en figuur 2). Daarentegen hersenen en ruggenmerg van PBS-geïnjecteerde en niet-zieke dieren bevatte slechts monomere species van gefosforyleerde alfa-synucleine.
Immunofluorescentiekleuring van de hersenen plakjes intraperitoneaal geïnjecteerd en zieke muizen met fosfo-specifiek antilichaam PSYN # 64 onthulde een brede verdeling van gefosforyleerde alfa-synucleine afzettingen gehele CNS (Tabel 2 en Figuur 3). Bovendien gefosforyleerde alfa-synucleine deposito colocalized met ubiquitine en p62 aangeeft een afwijkend proteïne homeostase die kunnen bijdragen aan de vorming van afzettingen.
De accumulatie van a-synucleïne aggregatie in zieke dieren ging gepaard met neuro-inflammatoire veranderingen, die werd gedetecteerd doorimmunofluorescentie kleuring voor GFAP, een merker voor astrocyten die reactief astrogliosis kan openbaren (figuur 4). Bovendien werden geactiveerde microglia ook gevonden in gebieden met veel alpha-synuclein pathologie door immunofluorescentie kleuring voor IBA-1 (geïoniseerd calciumbindende adaptermolecuul 1). Overeenkomstig, geopenbaard bioluminescentie verhoogde straling (> 2 x 10 6 p / s / cm2 / sr) uitgezonden door de hersenen van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen geïnjecteerd met alfa-synucleïne fibrillen, kort voordat ze ontwikkelden tekenen van neurologische ziekte. Daarentegen vertoonde hersenen van muizen geïnjecteerd met PBS tot een verhoging van glans vertonen. Verhoogde straling duidt op reactieve astrogliose, een kenmerk van zenuwontsteking, aangezien luciferase-expressie wordt aangedreven door de GFAP promoter.
Figuur 1: Injectie met alfa-synucleine fibrillen via de intraperitoneale route of intraglossal ziekte veroorzaakt in bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. (A) EM van gesonificeerd recombinant humaan alfa-synucleine fibrillen die werden intraperitoneaal en intraglossally geïnjecteerd in muizen. Negatieve kleuring met uranylacetaat werden multipele clusters korte, staafvormige aggregaten. Schaalbalken = 100 nm. (B) Kaplan-Meier blijkt dat na intraperitoneale injectie met alfa-synucleine fibrillen vier of vijf Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen ontwikkelden neurologische ziekte bij 229 ± 17 dagen (paarse gesloten vierkanten), terwijl geen van de PBS-geïnjecteerde controle muizen ontwikkelden tekenen van neurologische disfunctie binnen 420 dagen (paars open vierkantjes). Na intraglossal enting met alfa-synucleine fibrillen één muis van de vijf overleden na 285 dagen (groendichte cirkels). In contrast, geen van de PBS-geïnjecteerde controle muizen ontwikkelden neurologische ziekte of spontaan gestorven (groene open cirkels). Gemodificeerd van Breid et al. 2016 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Biochemische analyse van gefosforyleerde alfa-synucleine in het CZS van perifeer geïnjecteerd Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. (A) Immunoblotting met EP1536Y antilichaam herkennen op Ser129 fosforylering van alfa-synucleïne, bleek dat intraperitoneaal geïnjecteerde en zieke muizen geaccumuleerde hoog molecuulgewicht soort sarkosyl onoplosbare aggregaten van gefosforyleerd alfa-synucleine in hun hersenen eend ruggenmerg. Controlemuizen door challenging behandeld met PBS geen aggregaten van gefosforyleerd alfa-synucleine accumuleren en bevatte banden alleen voor de monomere vorm. (B) Na intraglossal challenge met alfa-synucleine fibrillen slechts één muis, dier 121, toonde Sarkosyl onoplosbare aggregaten van gefosforyleerd alfa-synucleine in de hersenen en het ruggenmerg, terwijl alle andere intraglossally geïnoculeerde muizen gezond bleven zonder afzettingen van alfa-synucleïne. Molecuulmassa's zijn in kilodalton. Monsterbelading in elke laan weergegeven door detectie van actine. Gemodificeerd van Breid et al. 2016 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Immunofluorescentie analyse blijkt dat afzettingen vangefosforyleerde alfa-synucleine colocalize met ubiquitine en p62 in de hersenen en ruggenmerg van zieke Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. Co-kleuring van gefosforyleerde alfa-synucleine, gedetecteerd met de EP1536Y antilichaam en ubiquitine bleek een duidelijke colocalisatie in de hersenen, zoals waargenomen in de thalamische kern (A) en ruggenmerg, zoals gedetecteerd in de grijze stof (B), van zieke muizen na intraperitoneale provocatie met alfa-synucleine fibrillen. Evenzo gefosforyleerde alfa-synucleine, gedetecteerd met de PSYN # 64 antilichamen, ook colocalized met p62 in de hersenen (C) en ruggenmerg (D) van zieke dieren. (A tot D) PBS-geïnjecteerde gezonde controledieren geen afzettingen of colocalisatie weergegeven voor elk van deze eiwitten. Nucleaire kleuring met DAPI is in blauw. Schaalbalken = 20 urn. Gemodificeerd van Breid et al. , 2016 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen ontwikkelden gliosis perifere na challenge met alfa-synucleine fibrillen. (A) Immunofluorescentie analyse van hersensecties van zieke dieren met een antilichaam tegen GFAP, een merker voor astrocyten, bleek reactief astrogliose in gebieden met afzettingen van gefosforyleerde alfa-synucleïne, die in de hersenstam met PSYN # 64 antilichamen werden gedetecteerd. Daarentegen was er geen reactieve astrogliose in hersenen van PBS-geïnjecteerde controlemuizen. (B) Op dezelfde kleuring met een antilichaam tegen IBA-1, een marker van microglia, toonde microgliosisin gebieden met afzettingen van gefosforyleerde alfa-synucleine in zieke dieren. Hersenen van gezonde, PBS-geïnjecteerde controle muizen geen tekenen van microgliosis vertonen. (C) Bioluminescentie beeldvorming onthulde verhoogde glans van de hersenen en ruggenmerg van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met alfa-synucleine fibrillen (linker paneel), veroorzaakt door de activering van de astrocyten , kort voor de muizen ontwikkelden neurologische symptomen. In de hersenen en ruggenmerg van PBS-geïnjecteerde controlemuizen niet de basale straling niet toenemen met de tijd (rechter paneel). Na intraglossal enting met alfa-synucleine fibrillen, een Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muis, dier 121, toonde tekenen van reactieve astrogliosis kort voordat hij stierf op 285 dagen (midden). (D) na intraperitoneale uitdaging Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen met alfa-synucleine fibrillen, increased niveaus van bioluminescentie (> 2 x 10 6 p / s / cm2 / sr) gemeten uit de hersenen van vier muizen (blauw, groen, bruin en oranje cirkels) enkele weken voordat ze ontwikkelden neurologische ziektesymptomen. Een van de vijf dieren vertoonden ook verhoogde niveaus van bioluminescentie kort voordat hij overleed 285 dagen na intraglossal injectie met alfa-synucleine fibrillen (magenta cirkels). Daarentegen voor gezonde, PBS-geïnjecteerde controlemuizen (zwarte cirkels; tonen foutbalken SD [n = 4]) en één dier dat niet ontwikkelen ziekte na intraperitoneale injectie met alfa-synucleine fibrillen (rode cirkels), de bioluminescentie signaal bleef onder een drempel van 2 x 10 6 p / s / cm2 / sr binnen de observatieperiode. Schaalbalken = 20 urn. Gemodificeerd van Breid et al. 2016 14. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
| muis lijn | Inoculum (gg) | Inenting route | Aantal muizen met ziekte / no. muizen geïnoculeerd | Gemiddelde overlevingstijd ± SD (dagen) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | humaan α-synucleine fibrillen (50) | intraperitoneale | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitoneale | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | humaan α-synucleine fibrillen (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabel 1: Inenting experimenten. * Gemodificeerd uit Breid et al., 2016 14
| Doelwit [antilichaamkloon] | gastheer | immunogeen | Verdunning in IF | Verdunning in WB |
| Actine [C4] | Muis | - | - | 1: 1000 |
| α-synucleïne, fosfo S129 [PSYN # 64] | Muis | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synucleïne, fosfo S129 [EP1536Y] | Konijn | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) | Konijn | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Konijn | - | 1: 500 | - |
| Sequestosoom-1 (p62) | Konijn | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitine [Ubi-1] | Muis | - | 1: 500 | - |
Tabel 2: Antilichamen gebruikt voor immunofluorescentie (IF) en Western blotting (WB). * Gemodificeerd uit Breid et al., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen is een gemakkelijke werkwijze voor neurologische ziekte gepaard gaat met inflammatoire processen induceert belangrijke kenmerken van synucleïne interageren recapituleren. Evenzo tong injectie vertegenwoordigt een andere weg voor neuroinvasion door alfa-synucleine prionoids in transgene muizen, maar minder efficiënt. We kozen ervoor om onze experimenten te beëindigen op 420 dagen na de injectie en kunnen we de mogelijkheid dat meer of alle van de fibril geïnjecteerde muizen ziekte kan hebben ontwikkeld op een later tijdstip niet uit te sluiten. Bovendien kan het gebruik van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen mogelijkheid voor niet-invasieve visualisatie van astrogliose en is een eenvoudige werkwijze voor het bewaken ontstekingsreacties veroorzaakt door neuroinvasion van alfa-synucleïne over de gehele levensduur van de muis.
Een kritische stap is de bereidingvan de entstof. Schijnbaar triviale factoren zoals verzameltijd, sonicatietijd de overvloed aan endotoxinen of de hoeveelheid fibrillen gebruikt voor injectie kan het resultaat van een experiment beïnvloeden door wijziging enten neiging van verkeerd gevouwen alfa-synucleine 21. Dus is het belangrijk om altijd dezelfde condities bij de voorbereiding van inocula voor injectie. Voor intraglossal injecties heeft om te worden beschouwd dat niet alleen de sublinguale zenuw, maar ook andere hersenzenuwen zoals de glossopharyngeus innerveren de tong en kon worden betrokken bij de Interneuronale transport van alpha-synuclein prionoids naar de hersenen. Aldus gericht is op verschillende gebieden van de tong kan leiden tot verschillende kinetiek verspreiden naar de hersenen. We hebben niet direct te injecteren in de sublinguale zenuw en het is mogelijk dat gericht op de hypoglossus CNS overdracht van alpha-synuclein prionoids zou kunnen verbeteren. Voor intraperitoneale injecties met alfa-synucleine fibrillen is critical dat de entstof correct in het buikvlies wordt geïnjecteerd en niet per ongeluk in de interne organen zoals de darm of blinde darm, die een negatieve neuroinvasion zouden kunnen beïnvloeden. Dit is ook belangrijk voor bioluminescentie bij het injecteren van D-luciferine. Rol van afwijkende D-luciferine aan inwendige organen zou kunnen vertragen de distributie naar de hersenen en resulteren in lagere bioluminescentie. Gelijkmatige resultaten te verkrijgen tijdens beeldvorming is het ook essentieel om altijd vers bereid de D-luciferine oplossing vóór de injectie en laten precies Incubeer 10 minuten na intraperitoneale injectie voor de beeldvorming.
Bioluminescentie is een nuttige methode om niet-invasief meten veranderingen in astrogliosis tijd en kan niet alleen worden toegepast of na intraperitoneale injecties intraglossal maar ook na elk type behandeling, waaronder, bijvoorbeeld, intracerebrale of intraveneuze injecties. Monitoren verspreiding van alfa-synucleïne prionoids van de periferie naar het CNS en de daaropvolgende neuroinflammation we gebruikten bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. Vanwege hemizygote expressie van alfa-synucleine in deze dieren is 40% lager ten opzichte van homozygote dieren vrij blijft van spontane ziekte gedurende maximaal 22 maanden en een geschikte genetische achtergrond voor alfa-synucleine transmissiestudies 13. Echter, veranderingen in de keuze van het muismodel voor bioluminescentie beeldvorming gewenst zijn. Een interessante optie is het gebruik monogene Tg (GFAP -Luc +/-) muizen die alleen luciferase als een transgen, dat een evaluatie van de prionoid gedrag van alfa-synucleine fibrillen op een achtergrond maakt dat in hoofdzaak wildtype voorzover alpha-synuclein betreft 14. Bovendien kruising Tg (GFAP -Luc +/-) muizen met andere transgene muizen, zoals Tg (SOD1 G93A) muizen amyotrofe laterale sclerose of Tg (APP23) mijs ziekte van Alzheimer, maakt beeldvorming van neuroinflammatie andere ziektemodellen 22, 23.
Een beperking van dit protocol is dat op basis van de plaats van injectie de geïnjecteerde inoculum kan een bepaalde hoeveelheid niet overschrijdt. Aldus injecties in de tong kan alleen worden uitgevoerd met een kleinere omvang dan in het peritoneum, die van invloed kunnen zendtijden aan het CNS. Een andere beperking is dat het GFAP -Luc transgen laat alleen detectie van astrogliosis maar niet microgliosis, wat even belangrijk inflammatoire processen. Tot slot, dit model niet inzichten verschaffen over hoe-alpha synucleïne prionoids bereikt de CNS na intraperitoneale injectie.
De toepassing van exogene alfa-synucleine prionoids via injectie is aangetoond dat een bruikbare werkwijze voor transmissie ketens die een cruciale rol spelen bij recapituleren kenmerken van synuclei bestuderennopathies. Intracerebrale injecties van recombinant alfa-synucleine fibrillen of ziekte- geassocieerde muis of humaan alfa-synucleine soorten in diermodellen werden gebruikt in verschillende studies hun zaaien eigenschappen en overdrachtsrendement tijd 5, 7, 17, 24, 25, 26 te analyseren. Aangezien stereotactische injecties in de hersenen altijd een plaatselijke ontstekingsreactie kort na de operatie te induceren, kan dit overdrachtweg invloed op de verspreiding en infectiviteit van het inoculum veroorzaakt door een wijziging van de hersenen homeostase. Recentere onderzoeken hebben de aandacht veranderd Perifere systemische toepassingen, niet primair om de chirurgische procedure te voorkomen, maar aan de periferie, de darmwand, skeletspier, of bloed te analyseren, als beginpunt van waaruit neuroinvasion aan het CZS zou tegelijkmmence 6, 9, 14, 27. Voor prionen is aangetoond dat transmissie door het buikvlies van de tong tot neuroinvasion en neurologische ziekten; Na tong infectie, prionen verspreid binnen twee weken op de hypoglossale kern in de hersenstam 11. Omdat alfa-synucleine werd besproken neuro-invasieve en zaaien eigenschappen zoals prionen hebben we aangetoond dat overdracht via de tong en het peritoneum vormen verdere toegangspunten alpha-synuclein prionoids aan het CNS 14 binnendringen. Kwantificering van astrogliosis door bioluminescentie maakt het volgen van de neuro-inflammatoire proces tijd en vertegenwoordigt een niet-invasief alternatief voor histologische analyse.
Om een dieper inzicht in hoe het centraal zenuwstelsel reageert op neuroinvasion van alpha-synuclein prionoids verkrijgenen andere behandelingen die zenuwontsteking veroorzaken, zou het gunstig zijn om muismodellen die ook niet-invasieve bewaking van microgliosis bijvoorbeeld mogelijk met een transgen dat luciferase expressie aandrijft van een promoter die specifiek is voor eiwitexpressie in microglia genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Olga Sharma, Theresa Hundt, en het personeel van de DZNE microscopie en dierlijke faciliteiten voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
