Imágenes de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos Después periférica La inoculación de la alfa-sinucleína fibrillas
Summary
Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo o la lengua de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación A53T familiar y luciferasa de luciérnaga, puede inducir la neuropatología, incluyendo la neuroinflamación , en su sistema nervioso central.
Abstract
Para estudiar el comportamiento prión de mal plegada alfa-sinucleína, se necesitan modelos de ratón que permiten la transmisión rápida y sencilla de prionoids alfa-sinucleína, que causan la neuropatología dentro del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe que intraglossal o inyección intraperitoneal de las fibrillas de alfa-sinucleína en bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que sobreexpresan la alfa-sinucleína humana con la mutación A53T desde el promotor de la proteína prión y luciferasa de luciérnaga a partir de el promotor para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), es suficiente para inducir la enfermedad neuropatológico. En comparación con Tg homocigotos (+ / + M83) ratones que desarrollan síntomas neurológicos severos partir de una edad de 8 meses, heterocigotos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) animales permanecen libres de la enfermedad espontánea hasta que llegan a una edad de 22 meses. Curiosamente, la inyección de las fibrillas de alfa-sinucleína a través de la intraperitoneal ruta indujo enfermedad neurológica con parálisis en cuatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones con una mediana de tiempo de incubación de 229 ± 17 días. animales enfermos mostraron depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína en el cerebro y la médula espinal. Las acumulaciones de alfa-sinucleína eran sarcosilo insoluble y colocalized con ubiquitina y p62, y fueron acompañadas por una respuesta inflamatoria que resulta en gliosis astrocítica y microgliosis. Sorprendentemente, la inoculación de las fibrillas de alfa-sinucleína en la lengua fue menos eficaz en la causa de la enfermedad, con sólo uno de los cinco animales inyectados que muestran patología alfa-sinucleína después de 285 días. Nuestros resultados muestran que la inoculación por vía intraglossal y más aún a través de la ruta intraperitoneal es adecuado para inducir la enfermedad neurológica con características pertinentes de sinucleinopatías en Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. Esto proporciona un nuevo modelo para el estudio de la patogénesis prión inducird por prionoids alfa-sinucleína en mayor detalle.
Introduction
Hay evidencia creciente de que la alfa-sinucleína tiene características que son similares a las de la proteína priónica, en particular en su capacidad de auto-semillas y se propagan mal plegamiento entre las células y a lo largo de las vías neuronales. Esta propiedad de la alfa-sinucleína también se conoce como 'prion-como' o 'prionoid', y es apoyado por observaciones en experimentos de trasplante, que sugieren la transmisibilidad de mal plegada alfa-sinucleína de neuronas enfermas a trasplantado recién neuronas sanas 1, 2 , 3, 4. También la inyección directa de mal plegada alfa-sinucleína en el cerebro o la periferia, por ejemplo, el músculo del miembro posterior o de la pared intestinal, resulta en una extensión de la patología de la alfa-sinucleína a partes distales del CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Se analizaron transmisión de prionoids alfa-sinucleína a través de rutas periféricas con más detalle y se dirigió a la cuestión de si mal plegada alfa-sinucleína puede neuroinvade el SNC después de una sola intraglossal o inyección intraperitoneal, una característica que anteriormente se había demostrado por priones, pero no para alfa- mal plegada sinucleína. Después de la inyección de los priones en la lengua, la neuroinvasión del SNC se logra a través de la propagación a lo largo del nervio hipogloso de la lengua que conduce al núcleo del nervio hipogloso, que se encuentra en el tronco cerebral 11. Como un modelo de ratón que elegimos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que sobreexpresan el mutante A53T de alfa-sinucleína humana a partir del promotor prión, y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de GFAP para controlar la activación de astrocitos por bioluminiscencia, como se muestra anteriormente en el cerebro deratones 12 priones infectados. En nuestras manos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) bigenic los ratones no desarrollaron la enfermedad hasta los 23 meses de edad como se ha demostrado por otros 13. Una sola inyección de fibrillas de alfa-sinucleína humanos a través de la intraglossal o enfermedad neurológica ruta inducida intraperitoneal con patología en el cerebro y médula espinal de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que apoyan la hipótesis de que prionoids alfa-sinucleína compartir características importantes con priones 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones representa un método fácil para inducir la enfermedad neurológica acompañada de la neuroinflamación recapitular características importantes de sinucleinopatías. Del mismo modo, la inyección lengua representa otra ruta para la neuroinvasión por prionoids alfa-sinucleína en ratones transgénicos, pero es menos eficiente. Hemos elegido para poner fin a los experimentos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Olga Sharma, Theresa Hundt, y el personal de las instalaciones de microscopía y animales DZNE de apoyo técnico.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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