הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
השיג התחדשות האקסון לאחר פגיעה במערכת העצבים הוא משימה מאתגרת 1. כדי ללמוד את הכישלון של התחדשות האקסון במערכת העצבים המרכזית (CNS), חוקרים השתמשו שפע של דגמים פגיעים עצבי. כמו אזורים של CNS השונים, חשוב להשתמש במודל מתאים אנטומית ללמוד התחדשות האקסון. באמצעות המודל המתאים, חוקרים יכולים לגבש טיפול ספציפי מבוסס על חומרת פציעה, סוג התאים העצבי של עניין, ואת דרך השדרה הרצויה להערכת התחדשות, בניגוד לאסטרטגיה טיפולית "אחד-על-כל".
בשנת פגיעה בחוט שדרה, למשל, על הסימפטומים המתישים ביותר נובעים אובדן תחושת התנועה. אובדן התחושה נגרם על ידי פגיעת המסלולים החושיים עולים, בעוד הפסד של תנועה נגרם על ידי פגיעת נתיבי התנועה יורדים. בשל הבדלים הסלולר אנטומיים בין TW אלהמסלולי o, מחקרי התחדשות האקסון רבים הממוקדות להתמקד רק אחד או במסלול האחר, עם הרציונל כי התאוששות מוצלחת של אחד תהיה יתרון עצום לחולים. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול המשתמשת גרעיני שורש הגבה ישירים הזרקה (DRG) עם וקטור ויראלי פציעת התאהבות במקביל שורש הגבי של חוט השדרה הצווארי התחתון של חולדת בוגרת כמודל ללמוד התחדשות האקסון חושית.
עצב סנסורי DRG הם שאחראים להעברת מידע חושי, כגון תחושת מישוש וכאב, מהפריפריה אל מערכת העצבים המרכזית. תחזיות axonal הארוכות של עצב סנסורי בחוט השדרה לשמש מודל טוב ללמוד התחדשות האקסון למרחקים ארוכים. בנוסף, כמו מכרסמים יכולים לשרוד נגע מסלול חושי כגון פציעת התאהבות שורש הגבה עם סיבוכי רווחה מינימאליים, חוקרים יכולים ללמוד התחדשות האקסון CNS ללא צורך נגע חוט השדרה לחלוטין. C5 מרובעת – C8 (L צוואר הרחםאיבל 5 – 8) הגבה התאהבות שורש פציעה הוכחה להיות מודל שימושי עבור בכפו deafferentation 2. בנוסף, פציעת התאהבות שורש הגבה מספקת מודל "מנקה" ללמוד התחדשות האקסון מאשר פגיע בחוט שדרה ישירה מכיוון שהוא אינו מסובך מגורמים אחרים כגון היווצרות צלקת גליה.
שימוש ריפוי גנטי נגיפי לתכנת מחדש תאי עצב למצב רגנרטיבית כבר ראה יותר ויותר כאסטרטגית טיפול מבטיחה למספר תנאי נוירולוגיות רבים 3. מחקרים הראו היישום של וירוס adeno קשור (AAV) וקטור נושא את הגן של חלבון מקדם גדילה יכולה להשיג התחדשות האקסון חזקה עם התאוששות התנהגותי 4, 5, 6. פתוגניות נמוכה לכאורה של AAV ב לעורר תגובה חיסונית ויכולת transduce תאים שאינם מתחלקים, כמו נוירונים, לעשותזה הווקטור האופטימלי עבור ריפוי גנטי. בנוסף, בצורת AAV רקומביננטי משמשת לטיפול. בצורה זו, שהיא אינה מסוגלת שילוב הגנום הנגיפי שלו לתוך המארח בגנום 7, הפחתת הסיכון mutagenesis insertional לעומת וקטורים ויראליים אחרים, כגון lentivirus. זה עושה AAV בחירה בטוחה ליישומי ריפוי גנטי.
כתוצאת DRG המכיל את גופי התא של הנוירונים חושיים, שזוהי המטרה אנטומי המתאימה ביותר עבור הממשל של וירוס עבור ריפוי גנטי ללמוד ו / או לקדם התחדשות האקסון חושית. במחקר שהשווה קפסיד AAV שונים lentivirus, AAV סרוטיפ 5 (AAV5) הוצגה להיות יעיל ביותר transducing נוירונים DRG מעל קורס זמן של 12 שבועות לפחות כאשר מוזרק ישירות לתוך DRG 8. בנוסף, AAV יכול להשיג יותר מ 40% יעילות התמרה, transducing כל תת העצבית DRG, כגון neurofilament בקוטר גדול 200 kDa(NF200) נוירונים -positive ואת קלציטונין קטן-קוטר גנים הקשורים פפטיד (CGRP) – או B4 isolectin (IB4) -positive נוירונים 4, 8.
כפי ההליך הכירורגי של הזרקת DRG ופציעת התאהבות שורש הגבה הוא מאוד פולשני ועדין, אנו מאמינים כי מאמר זה יעזור למשתמשים חדשים ללמוד את ההליך באופן יעיל מאוד. במאמר זה, אנו מציגים תוצאות נציגי חולדות בוגרות ארבעה שבועות לאחר ההזרקה של וירוס מלא AAV5-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) לתוך C6 – DRGs C7 עם C5 במקביל – פגיע למעוך שורש הגבה C8. דגם זה מתאים במיוחד עבור חוקרים שחקרו את השימוש בטיפול גנטי נגיפי לקדם התחדשות האקסון חושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים צעד-אחר-צעד מדריך כדי לבצע הזרקת DRG ופציעת התאהבות שורש הגבי של חוט השדרה הצווארי התחתון של חולדה בוגרת. כיוון שזה ניתוח פולשני ועדין מאוד, אנחנו ממליצים בחום לכל המשתמשים הפוטנציאליים לקבל הדרכה ותרגול מספיק לפני קידום לחיות ניתוח החיה. המשתמשים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של כריסטופר ודנה ריב קרן, המועצה למחקר רפואי, את ECMneuro המועצה האירופית למחקר, ומרכז למחקר ביו-רפואי בקיימברידג NHMRC. ברצוננו להביע את הכרת התודה העמוקה ביותר שלנו Heleen מרל ואן "ט Spijker ו יוסטינה באראט לקבלת הסיוע הטכני שלהם במהלך הצילומים. ברצוננו להודות לד"ר אליזבת Moloney ופרופ יוסט Verhaagen (מכון הולנד עבור Neuroscience) לסיוע בייצור AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
