後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
神経系損傷後の軸索再生を達成することは困難な作業である1。中枢神経系（CNS）における軸索再生の失敗を研究するために、研究者は神経損傷モデルの茄多を使用していました。 CNSの領域が異なるので、軸索再生を研究するために解剖学的に適切なモデルを使用することが重要です。適切なモデルを使用することにより、研究者は、「1対すべて」治療戦略とは反対に、傷害の重症度、関心の神経細胞の種類に基づいて特定の治療、および再生を評価するための必要な脊髄路を策定することができます。
脊髄損傷では、例えば、最も衰弱症状は感覚と運動の損失から生じます。運動の損失が下降運動経路への損傷によって引き起こされている間の感覚の喪失は、昇順感覚経路への損傷によって引き起こされます。これらTWの間の細胞および解剖学的な違いによるO経路、多くの標的に軸索再生の研究では、いずれか一方のみの成功回復が患者に多大な利益となることを根拠に、どちらか一方の経路に焦点を当てます。この記事では、ウイルスベクターおよび感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、成体ラットの下頸髄における同時後根挫滅損傷との直接の後根神経節（DRG）の注入を使用するプロトコルを提示します。
DRG感覚ニューロンは、周囲からCNSには、そのような触覚感覚や痛みなどの感覚情報を中継する責任があります。脊髄における感覚ニューロンの長い軸索投射は、長距離の軸索再生を研究するための良いモデルとなります。また、げっ歯類は、最小限の福祉合併症と後根挫滅損傷としての感覚経路の病変を生き残ることができるよう、研究者は完全に脊髄を病変部を必要とせずにCNSの軸索再生を学ぶことができます。四C5 – C8（頸部LEVEL 5から8）後根圧潰損傷は、前足の求心路遮断2のために有用なモデルであることが示されています。また、後根挫滅損傷は、それが、このようなグリア瘢痕形成など他の要因によって複雑ではないので、直接脊髄損傷よりも、軸索再生を研究する「クリーナー」モデルを提供します。
回生状態に神経細胞を再プログラムするウイルス遺伝子治療の使用は、ますます多くの神経学的状態3のための有望な治療戦略と考えられてきました。研究は、行動回復4、5、6とロバスト軸索再生を達成することができる成長促進タンパク質の導入遺伝子を担持するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの適用を示しています。免疫応答およびニューロンなどの非分裂細胞を形質導入する能力を誘発におけるAAVの見かけの低病原性は、作成しますその遺伝子治療のための最適のベクター。また、組換えAAV形態は、治療のために使用されます。この形態では、それは、宿主ゲノム7にそのウイルスゲノムを統合するようなレンチウイルスのような他のウイルスベクターに比べて挿入突然変異誘発のリスクを低減することができません。これは、AAV遺伝子治療用途のための安全な選択肢となります。
DRGは、感覚ニューロンの細胞体が含まれているとして、勉強および/または感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療用ウイルスの投与のための最も適切な解剖学的な目標です。異なるAAV血清型およびレンチウイルスを比較した研究では、AAV血清型5（AAV5）がDRG 8に直接注射したとき、少なくとも12週間の時間経過にわたってDRGニューロンを形質導入において最も効率的であることが示されました。さらに、AAVは、大径ニューロフィラメント200 kDaのような全てのDRGニューロンのサブタイプを、形質導入、40％以上の形質導入効率を達成することができます（NF200）陽性ニューロンと小径カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP） -またはイソレクチンB4（IB4）陽性ニューロン4,8。
DRG注射および後根挫滅損傷の手術手順としては非常に侵襲的で繊細で、我々はこの記事では、新しいユーザーは非常に効率的な方法で手順を学ぶために役立つと信じています。 C8後根挫滅損傷 – 同時C5とC7のDRGに – 本稿では、成人の4週間C6に対照ウイルスAAV5-GFP（緑色蛍光タンパク質）の注射後のラットからの代表的な結果を示しました。このモデルは、感覚軸索再生を促進するためのウイルス遺伝子療法の使用を調査している研究者のために特に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、我々は、成体ラットの下頸髄におけるDRG注射および後根挫滅損傷を実行するためのステップバイステップのガイドを提示します。これは非常に侵襲的で繊細な手術であるように、私たちは強く、すべての潜在的なユーザーは、動物の手術を生きるために進む前に、十分な訓練と実践を取得することをお勧めします。ユーザーは、脊髄の解剖学ではなく、周囲の筋肉組織、椎骨?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、クリストファーとデイナ・リーブ財団、医学研究評議会、欧州研究評議会ECMneuro、ケンブリッジNHMRC生物医学研究センターからの助成金によってサポートされていました。私たちは、撮影時の彼らの技術支援のためのヘリーン・メレルバン「トンSpijkerとユスティナバラットに心から感謝の意を表したいと思います。私たちは、AAVの生産を支援するために博士エリザベス・モロニー教授ジョースト・バーハーゲン（神経科学のためのオランダ研究所）に感謝したいと思います。
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
