Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Coltura cellulare monostrato non adeguato a modellare il comportamento in vivo dei tessuti, che comporta complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Tridimensionali tecniche di coltura (3D) delle cellule sono una recente innovazione sviluppata per colmare le lacune di coltura cellulare aderente. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare analoghi tessuti in vitro, questi metodi spesso sono complesse, costose da stabilire, richiedono attrezzature specializzate, e sono generalmente limitate dalla compatibilità con solo alcuni tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo rapida e flessibile per aggregare cellule in sferoidi 3D multicellulari di taglia costante che è compatibile con la crescita di una varietà di tumori e linee cellulari normali. Utilizziamo diverse concentrazioni di siero e metil cellulosa (MC) promuovere ancoraggio-indipendente generazione sferoide e prevenire la formazione di monostrati di cellule in un modo altamente riproducibile. Condizioni ottimali per indivlinee cellulari idual possono essere realizzati regolando MC o concentrazioni sieriche nel mezzo formazione sferoide. Gli sferoidi 3D generati possono essere raccolti per l'uso in una vasta gamma di applicazioni, tra cui segnalazione cellulare o studi di espressione genica, screening di farmaci candidati, o nello studio dei processi cellulari, come l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi clonali da singole cellule, e può essere adattato per valutare crescita ancoraggio-indipendente e anoikis-resistenza. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo facilmente modificabile per generare e utilizzare sferoidi cellulari 3D per ricapitolare microambiente 3D dei tessuti e modellare la crescita in vivo di cellule normali e tumorali.
Biologicamente rilevanti valutazione del comportamento delle cellule tumorali è impegnativo utilizzando tradizionali bidimensionali (2D) metodologie di coltura cellulare, in parte perché questi non riflettono adeguatamente il microambiente delle cellule presenti in vivo. Approcci alternativi comprendenti componenti della matrice extracellulare nella cultura (ad esempio, Boyden saggi da camera) sono fisiologicamente più rappresentativi dell'ambiente tessuti in vivo. Tuttavia, possono essere limitati a valutazione del comportamento singola cella, e non ricapitolano complesso in combinazioni vivo di cellula-matrice e cellula-cellula interazioni che contribuiscono al tessuto o tumore crescita 1, 2, 3.
L'uso di sferoidi multicellulari è un approccio recente che riproduce più accuratamente l'architettura compatta nella crescita cellulare vivo 1,4. Sferoidi possono essere usati per studiare le interazioni cellula-matrice di cellule normali, ma può anche agire come analoghi tumorali per modellare caratteristiche della progressione tumorale, come la crescita metastatica o resistenza ai farmaci 4.
Sferoidi possono essere formati dalla proliferazione di cellule singole annegate in una matrice 5, o più rapidamente, promuovendo l'aggregazione di più celle per formare un unico cluster cellulare (per esempio, appendere goccia, metodi centrifugazione) 6, 7. Esistenti tecniche di aggregazione delle cellule possono richiedere materiali costosi o di attrezzature specializzate. Inoltre, questi sferoidi hanno una vasta gamma di dimensioni e morfologie e possono essere difficili da produrre in grandi quantità, fare confronti tra le condizioni di crescita o trattamenti difficili. Infine, sferoidi generati da questi metodi possono essere difficile isolare dal extracel proteinicomatrice lular in cui sono incorporati da utilizzare in altre applicazioni.
Qui, descriviamo una metodologia di aggregazione cellulare robusto e facilmente modificabile per la rapida formazione di sferoidi di cellule di dimensioni sempre utilizzando disponibili in commercio piastre di celle-repellente U-basso e una matrice di adesione di promozione inerte, metilcellulosa. Una volta formati, questi sferoidi multicellulari sono facilmente isolati per uso in una vasta gamma di applicazioni. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi attraverso la proliferazione cellulare, che può essere utilizzato per valutare altri processi cellulari. Qui, dimostriamo saggi di invasione delle cellule, quantificati da immunofluorescenza, e un saggio anoikis, a titolo di esempio le applicazioni di queste due differenti protocolli di formazione sferoide.
Vi presentiamo un metodo rapido e flessibile per la produzione di sferoidi di cellule 3D per modellare l'architettura dei tessuti in vivo utilizzando reagenti poco costosi e facilmente reperibili. Il nostro protocollo sfrutta le proprietà non citotossiche e adesione di promozione di MC 8, 9 per mediare l'aggregazione delle cellule e ridurre al minimo la formazione di monostrato cellulare. Diversamente matrici a base di proteine isolate da…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Buffers | |||
10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Spheroid Formation | |||
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Invasion Assay | |||
Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Immunofluorescence Microscopy | |||
#1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |