Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Coltura cellulare monostrato non adeguato a modellare il comportamento in vivo dei tessuti, che comporta complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Tridimensionali tecniche di coltura (3D) delle cellule sono una recente innovazione sviluppata per colmare le lacune di coltura cellulare aderente. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare analoghi tessuti in vitro, questi metodi spesso sono complesse, costose da stabilire, richiedono attrezzature specializzate, e sono generalmente limitate dalla compatibilità con solo alcuni tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo rapida e flessibile per aggregare cellule in sferoidi 3D multicellulari di taglia costante che è compatibile con la crescita di una varietà di tumori e linee cellulari normali. Utilizziamo diverse concentrazioni di siero e metil cellulosa (MC) promuovere ancoraggio-indipendente generazione sferoide e prevenire la formazione di monostrati di cellule in un modo altamente riproducibile. Condizioni ottimali per indivlinee cellulari idual possono essere realizzati regolando MC o concentrazioni sieriche nel mezzo formazione sferoide. Gli sferoidi 3D generati possono essere raccolti per l'uso in una vasta gamma di applicazioni, tra cui segnalazione cellulare o studi di espressione genica, screening di farmaci candidati, o nello studio dei processi cellulari, come l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi clonali da singole cellule, e può essere adattato per valutare crescita ancoraggio-indipendente e anoikis-resistenza. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo facilmente modificabile per generare e utilizzare sferoidi cellulari 3D per ricapitolare microambiente 3D dei tessuti e modellare la crescita in vivo di cellule normali e tumorali.

Introduction

Biologicamente rilevanti valutazione del comportamento delle cellule tumorali è impegnativo utilizzando tradizionali bidimensionali (2D) metodologie di coltura cellulare, in parte perché questi non riflettono adeguatamente il microambiente delle cellule presenti in vivo. Approcci alternativi comprendenti componenti della matrice extracellulare nella cultura (ad esempio, Boyden saggi da camera) sono fisiologicamente più rappresentativi dell'ambiente tessuti in vivo. Tuttavia, possono essere limitati a valutazione del comportamento singola cella, e non ricapitolano complesso in combinazioni vivo di cellula-matrice e cellula-cellula interazioni che contribuiscono al tessuto o tumore crescita ^{1, 2, 3.}

L'uso di sferoidi multicellulari è un approccio recente che riproduce più accuratamente l'architettura compatta nella crescita cellulare vivo ^1,4. Sferoidi possono essere usati per studiare le interazioni cellula-matrice di cellule normali, ma può anche agire come analoghi tumorali per modellare caratteristiche della progressione tumorale, come la crescita metastatica o resistenza ai farmaci ^4.

Sferoidi possono essere formati dalla proliferazione di cellule singole annegate in una matrice ^5, o più rapidamente, promuovendo l'aggregazione di più celle per formare un unico cluster cellulare (per esempio, appendere goccia, metodi centrifugazione) ^{6, 7.} Esistenti tecniche di aggregazione delle cellule possono richiedere materiali costosi o di attrezzature specializzate. Inoltre, questi sferoidi hanno una vasta gamma di dimensioni e morfologie e possono essere difficili da produrre in grandi quantità, fare confronti tra le condizioni di crescita o trattamenti difficili. Infine, sferoidi generati da questi metodi possono essere difficile isolare dal extracel proteinicomatrice lular in cui sono incorporati da utilizzare in altre applicazioni.

Qui, descriviamo una metodologia di aggregazione cellulare robusto e facilmente modificabile per la rapida formazione di sferoidi di cellule di dimensioni sempre utilizzando disponibili in commercio piastre di celle-repellente U-basso e una matrice di adesione di promozione inerte, metilcellulosa. Una volta formati, questi sferoidi multicellulari sono facilmente isolati per uso in una vasta gamma di applicazioni. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi attraverso la proliferazione cellulare, che può essere utilizzato per valutare altri processi cellulari. Qui, dimostriamo saggi di invasione delle cellule, quantificati da immunofluorescenza, e un saggio anoikis, a titolo di esempio le applicazioni di queste due differenti protocolli di formazione sferoide.

Protocol

NOTA: Tutti i reagenti e materiali di consumo sono elencati nella Lista dei materiali. 1. Produzione Spheroid da Cell aggregazione Soluzione metil cellulosa: Preparare 100 ml di 100 mg / mL metil cellulosa. Calore 50 mL ultrapura H 2 O a 80 ° C. Aggiungere 10 g di polvere di cellulosa di metile e agitare fino a quando le particelle sono uniformemente disperse. Portare a volume finale con ultrapura freddo H 2</su…

Representative Results

Descriviamo un metodo flessibile ed efficace per generare sferoidi discreti utilizzando piastre di celle-repellenti e mezzi di formazione sferoide integrato con MC. Nelle condizioni appropriate di MC e siero, singole cellule depositano ed aderiscono insieme al centro del pozzo per formare sferoidi con minima aderenza al fondo del pozzetto. Usando questo protocollo, sferoidi sono stati generati da una varietà di linee cellulari (Figura 2B). Titolazione di MC e le concent…

Discussion

Vi presentiamo un metodo rapido e flessibile per la produzione di sferoidi di cellule 3D per modellare l'architettura dei tessuti in vivo utilizzando reagenti poco costosi e facilmente reperibili. Il nostro protocollo sfrutta le proprietà non citotossiche e adesione di promozione di MC ^{8, 9} per mediare l'aggregazione delle cellule e ridurre al minimo la formazione di monostrato cellulare. Diversamente matrici a base di proteine ​​isolate da…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer