Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.
Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo en combinaciones in vivo de célula-matriz y célula-célula interacciones que contribuyen a tejido o tumor de crecimiento 1, 2, 3.
El uso de esferoides multicelulares es un enfoque reciente que reproduce con mayor precisión la arquitectura compacta de crecimiento in vivo de células 1,4. Los esferoides se pueden utilizar para investigar las interacciones célula-matriz de las células normales, pero también pueden actuar como análogos tumorales para modelar características de la progresión del tumor, como el crecimiento metastásico o resistencia a los medicamentos 4.
Los esferoides pueden formarse por la proliferación de células individuales embebidos en una matriz de 5, o más rápidamente, mediante la promoción de la agregación de múltiples células para formar un clúster sola célula (por ejemplo, gota colgante, métodos de centrifugación) 6, 7. técnicas de agregación de células existentes pueden requerir materiales costosos o equipo especializado. Además, estos esferoides tienen una amplia gama de tamaños y morfologías y pueden ser difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo las comparaciones entre las condiciones de crecimiento o tratamientos difíciles. Finalmente, esferoides generados por estos métodos pueden ser difíciles de aislar de la extracel proteináceolular matriz en la que están inmersos para su uso en otras aplicaciones.
A continuación, se describe un método de agregación celular robusto y fácilmente modificable para la rápida formación de esferoides de células de tamaño constantemente utilizando placas disponibles comercialmente de fondo en U de células repelente y una matriz inerte que promueve la adhesión, metil celulosa. Una vez formados, estos esferoides multicelulares son fácilmente aislados para su uso en una amplia gama de aplicaciones. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides a través de la proliferación celular, que puede utilizarse para evaluar otros procesos celulares. Aquí, se muestra ensayos de invasión celular, cuantificados mediante tinción de inmunofluorescencia, y un ensayo de anoikis, como ejemplo, las aplicaciones de estos dos protocolos diferentes de formación de esferoides.
Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC 8, 9 para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Buffers | |||
10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Spheroid Formation | |||
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Invasion Assay | |||
Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Immunofluorescence Microscopy | |||
#1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |