Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita del nervo
Summary
L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.
Abstract
L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre metodi di preparazione e caratterizzazione per le nanoparticelle (NP) di carico di NFF-caricato, ad alta densità, lipoproteine (HDL). Le HDL sono NPs endogene e sono state esplorate come veicoli per la consegna di agenti terapeutici. Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. Tuttavia, sono generalmente complicate, richiedono molto tempo e sono difficili per la scala industriale. In questo studio, l'omogeneizzazione in un passo è stata usata per mescolare gli eccipienti e formare i prototipi NP. NGF è una proteina solubile in acqua di 26 kDa. Per facilitare l'incapsulamento di NGF nell'ambiente lipidico dei NP NPN che imitano HDL, la protamina USP è stata usata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF per neutralizzare le cariche sulla superficie NGF. Il complesso NGF / protamina è stato quindi introdotto nei prototipi NP. Apolipoproteina AI è stata finalmente ricoperta sulla superficie dei NP. NGF HDL-imitando NP hanno mostrato preferibili proprietà in terminiS di dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, efficienza di entrapment, rilascio in vitro , bioattività e biodistribuzione. Con l'accurata progettazione e l'esplorazione dell'omogeneizzazione in NPs che imitano HDL, la procedura è stata notevolmente semplificata e gli NP sono stati resi scalabili. Inoltre, sono state superate diverse sfide, come la separazione di NGF scaricati dai NP, che conduce affidabili studi di rilascio in vitro e misurando la bioattività dei NP.
Introduction
Macromolecole, come proteine, peptidi e acidi nucleici, stanno emergendo come farmaci promettenti e hanno guadagnato una notevole attenzione negli ultimi decenni 1 , 2 . A causa della loro elevata efficacia e modalità di azione specifica, essi presentano un grande potenziale terapeutico per i trattamenti del cancro, della malattia immunitaria, dell'HIV e delle condizioni correlate 3 , 4 . Tuttavia, le proprietà fisiochimiche, come la loro grande dimensione molecolare, la struttura tridimensionale, le cariche superficiali e la natura idrofila, rendono la consegna in vivo di queste macromolecole molto impegnative. Ciò ostacola notevolmente il loro uso clinico 4 . Recenti progressi nei sistemi di erogazione di farmaci, come microparticelle, nanoparticelle polimeriche (NP), liposomi e NPs lipidi, hanno superato queste sfide e migliorato significativamente la distribuzione in vivo di macromolecole. HoTuttavia, sono stati rivelati alcuni inconvenienti riguardanti questi carichi di consegna, tra cui la scarsa capacità di caricamento del farmaco, l'efficienza di scarsa entrapment, l'emivita breve, la perdita di bioattività e gli effetti collaterali indesiderati 5 , 6 , 7 , 8 . Sistemi di trasporto efficaci rimangono un'area di interesse di ricerca. Inoltre, lo sviluppo di metodi analitici per caratterizzare NPs caricati da droga è più impegnativo per le macromolecole che per le piccole molecole.
La lipoproteina ad alta densità (HDL) è un NP naturale composto da un nucleo lipidico rivestito da apolipoproteine e da un monosilofo fosfolipido. L'HDL endogeno svolge un ruolo fondamentale nel trasporto di lipidi, proteine e acidi nucleici attraverso la sua interazione con i recettori target, come SR-BI, ABCAI e ABCG1. È stato esplorato come veicolo per la consegna di diversi agenti terapeutici 9, 10 , 11 , 12 . Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. La dialisi è un approccio popolare. In questo metodo, i NP sono formati dall'idratazione di un film lipidico utilizzando la soluzione di colato di sodio. Il sale viene quindi rimosso attraverso una dialisi di 2 giorni con tre tamponi 13 . I metodi di sonicazione fabbricano NP facendo subire una miscela lipidica per 60 min sotto una condizione di riscaldamento; I NP sono ulteriormente purificati mediante gel cromatografia 14 . La microfluidica genera NP attraverso un dispositivo microfluidico che mescola le soluzioni di fosfolipidi e apolipoproteine AI (Apo AI) creando microvortici in un modello di messa a fuoco 15 . Chiaramente, questi metodi possono richiedere molto tempo, duri e difficili per la scala industriale.
In questo articolo introdurremo la preparazione e la caratterizzazione di nuovi NPs imitanti HDL per il nervoL'incapsulamento del fattore di crescita (NGF). NGF è un omodimero di polipeptidi legato al disolfuro contenente due monomeri di polipeptidi di 13,6 kDa. È stata sviluppata una nuova procedura per la preparazione dei NP mediante omogeneizzazione, seguita dall'incapsulamento di NGF nei NP. I NP NPN di NGF sono stati caratterizzati per dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, potenziale zeta e rilascio in vitro . La loro bioattività è stata valutata per la crescita del neurite nelle cellule PC12. La biodistribuzione di NPs NGF HDL-imitanti è stata confrontata con quella di NGF libera dopo l'iniezione endovenosa nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio dimostriamo un metodo semplice per preparare NPs imitanti HDL per l'incapsulamento di NGF. Sono stati studiati diversi sistemi di erogazione di NP per fornire proteine. Attualmente, molti preparati NP coinvolgono la dialisi, la precipitazione dei solventi e l'idratazione del film. Questi processi sono generalmente complessi e impegnativi in termini di scalabilità. Durante questo sviluppo di NP, è stato determinato che i lipidi avevano una forte adesione alla parete di vetro del contenito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
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