신경 성장 인자 인 캡슐 레이션을위한 새로운 HDL 모방 나노 입자의 제조 및 특성 규명
Summary
간단한 균질화를 사용하여 신경 성장 인자를 캡슐화하기위한 고밀도의 고밀도 지단백질 모방 나노 입자를 제조 하였다. 과제, nanoparticle 준비, 시험관 특성 및 생체 내 연구에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에서 설명합니다.
Abstract
이 기사의 목적은 신경 성장 인자 (NGF) – 부하 된 고밀도 지단백질 (HDL) – 흉내내는 나노 입자 (NP)에 대한 준비 및 특성화 방법을 소개하는 것입니다. HDL은 내인성 NP이며 치료제를 전달하기위한 수단으로 사용됩니다. HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 그러나, 이들은 일반적으로 복잡하고, 시간 소모적이며, 산업적 규모면에서 어렵다. 이 연구에서는 1 단계 균질화를 사용하여 부형제를 혼합하고 원형 NP를 형성했습니다. NGF는 26 kDa의 수용성 단백질이다. HDL 모방 NP의 지질 환경으로의 NGF 캡슐화를 촉진하기 위해 프로타민 USP를 사용하여 NGF와 이온 쌍을 형성시켜 NGF 표면의 전하를 중화시켰다. NGF / 프로타민 복합체는 원형 NP에 도입되었다. 최종적으로 Apolipoprotein AI가 NP의 표면에 코팅되었다. NGF HDL 모방 NP는 장기간에 바람직한 특성을 보였다입자 크기, 크기 분포, 포착 효율, 생체 외 방출, 생체 활성 및 생체 분포에 관한 정보를 제공합니다. HDL 모방 NP의 조심스럽게 설계 및 균질화를 통해 절차가 크게 단순화되었으며 NP는 확장 성을 갖게되었습니다. 더욱이, NP로부터 무부하 NGF를 분리하고, 신뢰할 수 있는 시험 관내 방출 연구를 수행하고, NP 의 생체 활성을 측정하는 것과 같은 다양한 과제가 극복되었다.
Introduction
단백질, 펩타이드 및 핵산과 같은 거대 분자는 유망한 약물로 등장하여 지난 수십 년 동안 상당한 주목을 받았다. 높은 효능과 특수한 행동 방식으로 인해 암, 면역 질환, HIV 및 관련 질병 치료에 큰 치료 잠재력을 나타냅니다 3 , 4 . 그러나, 큰 분자 크기, 3 차원 구조, 표면 전하 및 친수성과 같은 물리 화학적 성질은 이러한 거대 분자의 생체 내 전달을 매우 어렵게 만든다. 이것은 그들의 임상 적 사용을 상당히 방해한다. 미립자, 고분자 나노 입자 (NP), 리포좀 및 지질 NP와 같은 약물 전달 시스템의 최근 발전은 이러한 과제를 극복하고 고분자 의 생체 내 전달을 크게 향상시켰다. 호경미한 로딩 용량, 낮은 포착 효율, 짧은 반감기, 생체 활성 상실 및 바람직하지 못한 부작용 5 , 6 , 7 , 8을 포함 하여 이러한 운반화물에 관한 몇 가지 단점이 밝혀졌습니다. 효과적인 운송 시스템은 여전히 연구 관심 분야입니다. 더욱이, 약물 로딩 된 NP를 특성화하기위한 분석 방법의 개발은 작은 분자에 비해 거대 분자에 대해 더욱 어렵습니다.
고밀도 지단백질 (HDL)은 아포지 단백질 (apolipoproteins)과 인지질 단층 (phospholipid monolayer)으로 코팅 된 지질 코어로 구성된 천연 NP입니다. 내인성 HDL은 SR-BI, ABCAI 및 ABCG1과 같은 표적 수용체와의 상호 작용을 통해 지질, 단백질 및 핵산의 전달에 중요한 역할을합니다. 다른 치료제를 전달하기위한 수단으로 탐구되어왔다., 10 , 11 , 12 . HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 투석은 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법에서는 NP 콜레스테롤 솔루션을 사용하여 지질 필름을 수화하여 NPs가 형성됩니다. 그런 다음 소금을 3 개의 완충액으로 2 일간 투석하여 제거합니다 13 . Sonication 방법은 가열 조건 하에서 60 분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리하여 NP를 제조한다. NP는 겔 크로마토 그래피 14 를 통해 추가로 정제된다. Microfluidics는 농축 패턴 15 microvortices을 만들어서 phospholipids과 apolipoprotein AI (Apo AI) 솔루션을 혼합 microfluidic 장치를 통해 NPs를 생성합니다. 분명히, 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고, 거칠며, 산업 규모가 커질 수 있습니다.
이 기사에서는 신경을위한 새로운 HDL 모방 NP의 준비와 특성화를 소개합니다성장 인자 (NGF) 캡슐화. NGF는 2 개의 13.6 kDa 폴리펩티드 단량체를 함유하는 이황화 결합 폴리 펩타이드 호모 다이머이다. NGF를 NP에 캡슐화 한 후 균질화하여 NP를 제조하는 새로운 방법이 개발되었다. NGF HDL 모방 NP는 입자 크기, 크기 분포, 제타 전위 및 시험관 내 방출 에 대해 특징 지어졌다. 이들의 생체 활성을 PC12 세포에서 신경 돌기 성장 (neurite outgrowth)으로 평가 하였다. NGF HDL 모방 NP의 생체 분포는 생쥐에서의 정맥 주사 후 유리 NGF의 생체 분포와 비교되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 NGF 캡슐화를 위해 HDL 모방 NP를 준비하는 간단한 방법을 시연합니다. 다양한 NP 전달 시스템이 단백질을 전달하기 위해 연구되었습니다. 현재 많은 NP 준비 과정에는 투석, 용매 침전 및 필름 수화가 포함됩니다. 이러한 프로세스는 일반적으로 규모가 커질 경우 복잡하고 까다로운 작업입니다. 이 NP 발달 동안, 지질은 용기의 유리 벽에 강한 접착력을 가지므로 박막을 수화하고 부형?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Dong, X.에 NIH R03 NS087322-01에 의해 지원되었다.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
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