Summary
В этой работе представлена новая модель сегментарного повреждения почек in vivo с использованием трансгенного даниофата почки GFP. Модель позволяет индуцировать целенаправленную абляцию эпителиальных клеток почек, чтобы показать клеточные механизмы повреждения и восстановления нефронов.
Abstract
Острая почечная травма (AKI) является распространенным заболеванием с высокой смертностью. С восстановительными способностями почки можно восстановить адекватную функцию почек после поддерживающего лечения. Тем не менее, лучшее понимание того, как происходит смерть и восстановление клеток нефронов на клеточном уровне, необходимо для минимизации гибели клеток и для улучшения процесса регенерации. Пронефрос рыбок данио является хорошей модельной системой для достижения этой цели, поскольку содержит анатомические сегменты, сходные с нефроном млекопитающих. Раньше наиболее распространенной моделью, используемой для исследования повреждения почек у рыб, была фармакологическая модель гентамицина. Однако эта модель не позволяет обеспечить точное пространственно-временное управление травмой, и, следовательно, трудно исследовать клеточные и молекулярные процессы, связанные с восстановлением почек. Чтобы преодолеть это ограничение, эта работа представляет собой метод, с помощью которого, в отличие от подхода гентамицина, специфический зеленый люминесцентный белок (GFP) -exПрессовый нефронный сегмент может быть фотоизолирован с использованием фиолетового лазерного излучения (405 нм). Эта новая модель AKI дает много преимуществ, которых не хватает другим методам эпителиального повреждения. Его главными преимуществами являются способность «набирать» уровень травмы и точный пространственно-временный контроль в устойчивой модели животного животного in vivo . Этот новый метод может значительно повысить уровень понимания механизмов повреждения почек и восстановления.
Introduction
Острая почечная травма (AKI) 1 , 2 , которая также может упоминаться как острая почечная недостаточность, широко определяется как внезапное нарушение функции почек 3 . Хотя уровень понимания этого состояния значительно улучшился за последние годы, показатели заболеваемости и смертности остались высокими 1 , 2 . Текущая обработка этого состояния в основном благоприятна, поскольку результаты нескольких клинических испытаний лекарственной терапии были отрицательными 4 , 5 . Почка уникальна тем, что обладает способностью восстанавливать себя. Поэтому поддерживающая терапия после ранней диагностики АКИ является наилучшим способом ограничения заболеваемости 6 . Тем не менее, трудно обнаружить АКИ раньше, а смертность - ошеломляющая 50-80% для тех, кто нуждается в диализе 5, С возможностью восстановления почек и отсутствия вариантов лечения для этого состояния важно разработать методы для усиления этого процесса регенерации нефронов.
Было много различных моделей, используемых для исследования AKI, которое включает в себя различные средства травм и модели животных. В терминах агентов повреждения почек аминогликозидный антибиотик гентамицин использовался в качестве нефротоксического агента, который приводит к АКИ 7 , 8 . Однако несколько групп обнаружили, что лечение гентамицином является смертельным для эмбриона 9 рыбок данио. Это приводит к повреждению трубчатой оболочки, что является слишком серьезным для восстановления эмбриона, что затрудняет исследование регенерации без какого-либо вмешательства. Модели млекопитающих, такие как мышь и крыса, также считаются ценными, но при изучении АКИ они сталкиваются со многими ограничениями. Возможно, главным недостатком моделей грызунов является трудностьЛизирования почки грызунов и, таким образом, определения точных пространственно-временных процессов, ведущих к эпителиальной смерти и восстановлению.
Johnson et al. Сообщили о методе лазерной абляции для индуцирования острой почечной недостаточности у эмбриональных и личиночных рыбок данио 9 . Они использовали импульсную лазерную абляцию для повреждения почек после внутримышечной инъекции декстрановыми конъюгатами. Флуоресценция из декстрановых конъюгатов позволяет визуализировать повреждение и регенерацию в эпителии трубочки 9 . Эта модель преодолевает два ограничения, упомянутые выше, но не позволяет оценивать уровни травм и их трудно выполнять на больших, произвольных группах клеток.
Новая описанная здесь новая модель лазерного моделирования данио-волны, основанная на абляции, описывает все перечисленные выше ограничения. Пронефрическая почка у личиночных рыбок данио представляет собой зрелый, функционирующий орган, который содержит сегменты, сходные с млекопитающим nePhron, включая клубочковый, проксимальный и дистальный канальцы, и сборный канал 10 . Личинки данио также являются оптически прозрачными, что делает возможным наблюдение за почками через флуоресцентные методы. Таким образом, рыбка данио представляет собой ценную in vivo модель AKI, а личиночная прооннефтная почка (5-12 дней после оплодотворения (dpf)) может быть использована для изучения клеточных и молекулярных процессов, связанных с повреждением и восстановлением почек.
В этой статье представлен метод, посредством которого конкретные зеленые флуоресцентные белки (GFP) -экспрессирующие нефронные сегменты могут быть фотоизолированы с использованием низкоэнергетического (по сравнению с импульсно-лазерным) фиолетового лазерного излучения (405 нм). Флуоресценция GFP позволяет нацеливать группу клеток, делая изменения, которые происходят видимыми благодаря наблюдению за фотообесцвечиванием GFP. Кроме того, GFP (поглощая фиолетовый свет) служит в качестве поглотителя энергии, чтобы потенцировать повреждение в GFP-экспрессирующих почках. Микроскопы с временным разрешениемКопия затем может быть использована для изучения процесса ремонта. Исследования показали, что клеточная пролиферация, миграция клеток и метаплазия клеток 11 , 12 , 13 - все это потенциальные процессы, которые могут играть важную роль в восстановлении почек. Однако относительную важность этих процессов и детали их взаимодействия трудно выявить из-за ограничений существующих моделей AKI. Используя этот новый подход, можно было показать, что миграция клеток играет центральную роль в восстановлении почек после острой травмы 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных для остеопатической медицины NYITCOM (NYICCOM IACUC). Все операции и эксперименты in vivo проводились под трикаиновой анестезией, и все усилия были направлены на минимизацию страданий.
1. Получение и поддержание эмбрионов
- Получают эмбрионы, пересекая почки GFP люминесцентные данио.
ПРИМЕЧАНИЕ. Примеры флюоресцентно меченных трансгенных линий данио представлены в таблице 1 . - Храните эмбрионы при 28,5 ° C в растворе E3 в течение 24 часов после внесения удобрений.
- Через 24 часа замените среду раствором E3, содержащим 0,003% 1-фенил-2-тиомочевину (PTU).
ПРИМЕЧАНИЕ: PTU используется, поскольку он блокирует зависимые от тирозиназы стадии в меланогенезеИ, следовательно, предотвращает пигментацию. Здесь это решение называется E3-PTU. - Поднимите оплодотворенные эмбрионы при 28,5 ° C, пока они не достигнут> 6 dpf, после чего почки созрели.
ПРИМЕЧАНИЕ. Лучше использовать личинки в окне 7-9 dpf. - Используя флуоресцентный рассекающий микроскоп с 40-кратным увеличением и фильтрами с зеленой флуоресцентной эмиссией, выберите личинок с яркой флуоресценцией GFP почки.
2. Установка рыбок для данио для живых изображений
- Если фотобаблирование эмбрионов до 3 дпф, удалите хорион с любого незамученного рыбок данио до установки рыбок данио для визуализации.
- Вручную дехрорируйте с помощью щипцов (предпочтительно) или используйте химическую обработку с помощью смеси протеаз.
ПРИМЕЧАНИЕ. Дефорирование позволяет получить наилучшие результаты визуализации.
- Вручную дехрорируйте с помощью щипцов (предпочтительно) или используйте химическую обработку с помощью смеси протеаз.
- Промойте обломки хориона в чашке Петри, используя раствор E3-PTU, и пополните блюдо с помощью E3-PTU.
- ПодготовительномПовторную 1-2% -ную агарозу с низкой точкой плавления (LMP) с раствором трикаина 0,2 мг / мл для установки рыбок данио для фотобаблирования почек и живого изображения.
- Если LMP-агароза уже приготовлена заранее, повторно нагрейте ее в микроволновой печи, чтобы расплавить ее.
- После приготовления агарозы LMP поместите 35-миллиметровую пластиковую чашку Петри на рассекающий микроскоп. Поместите вытащенный стеклянный зонд поблизости, чтобы правильно ориентировать обезболивающих личинок.
ПРИМЕЧАНИЕ. Важно сделать этот шаг своевременно и иметь все на месте, потому что эмбрионы должны быть ориентированы до того, как агароза застынет примерно через 1-3 мин. - Перед переносом эмбриона в агарозу убедитесь, что агароза холодная ( т.е. при температуре тела). Используйте пластиковую или стеклянную пипетку, чтобы поместить эмбрион в охлажденный расплавленный раствор агароз-трикаин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это делается потому, что слишком жаркая агароза может нанести ущерб эмбриону, что приведет к остановке сердцаИли смерть - Используя переносную пипетку, перерисуйте эмбрион в растворе агарозы и поместите эмбрион / личинку посередине 35-миллиметровой тарелки.
- Быстро разложите агарозу, содержащую эмбрион / личинку, чтобы равномерно покрыть дно 35-миллиметровой тарелки; Лучший объем используемой агарозы составляет ~ 1-1,1 мл.
- Используйте стеклянный зонд, чтобы сориентировать эмбрион в наилучшем возможном положении для фотобаблирования и визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ. Фильм 1 показывает наилучшую ориентацию эмбриона / личинки для односторонней фотоаблации. Этот шаг является наиболее чувствительным к времени и должен выполняться быстро, прежде чем агароза начнет гель, так как любая попытка переориентировать рыбу после начала гелеобразования является вредной.- Ориентируйте личинку так, чтобы представляющий интерес сегмент почки был перпендикулярен пути луча, в то время как контралатеральный сегмент находился далеко от лазерного луча (см. Фильм 1 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Этого можно добиться, повернув личинку, как показано в фильме 1 . - Дайте около 15 минут для затвердевания агарозы. Накройте чашу Петри, чтобы свести к минимуму испарение. Как только агароза затвердеет, эмбрион или личинка готовы к фотоаблации.
3. Лазерная абляция
- Управлять конфокальной системой визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании ссылочной платформы обработки изображений (см. Таблицу материалов) рекомендуемые настройки включают в себя 40-кратное увеличение, объектив с погружением 0,8 NA и первое дихроичное зеркало, которое позволяет обеспечить как 488, так и 405 нм освещение образца. Обнаружение должно выполняться на зеленом канале. - Поместите блюдо, содержащее иммобилизованное данио, на конфокальную стадию.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта процедура оптимизирована для вертикальной конфигурации с использованием 40-60X водоохлаждающейся линзы. Тем не менее, должно быть возможно изменить процедуру для инвертированного микроскопа. - В вертикальной конфигурации расположите чашку Петри, содержащую эмбрион, поверх микроскопаOpe slide и удерживайте его на месте , используя модельную глину ( например, пластилин). Поместите стеклянный предмет с чашкой Петри на стадию конфокального микроскопа.
- Добавьте 3 мл раствора для визуализации E3-PTU (см. Шаг 1.3) с 0,2 мг / мл трикаина.
ПРИМЕЧАНИЕ. Решение для создания изображений можно также добавить сразу же после установки слайда на сцене. Добавление раствора для изображений следует делать очень осторожно, чтобы предотвратить агарозу от дна блюда. - Переключитесь на окунающую воду линзу (40 или 60X). Медленно поднимите сцену, убедившись, что объектив слегка под углом, чтобы предотвратить попадание воздуха в траекторию луча. Как только линза коснется раствора под углом, центрируйте его так, чтобы он находился в поле зрения эмбрионов.
- Найдите интересующий сегмент, используя источник флуоресцентного света. Поверхностно расположите ветвь, нацеленную на повреждение, чтобы минимизировать рассеяние света (см. Фильм 1 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательность(См. Таблицу), но эта процедура может быть легко адаптирована к другим платформам. - Откройте программное обеспечение. Перейдите к «Вид» | «Контроль за приобретением» | «C2plus Compact GUI» и установить «время ожидания пикселя» до «1.9 мкс», «размер кадра» до «512 х 512 пикселей» и «размер обскуры» до «90 мкм». Установите «405 нм (или 408 нм в некоторых системах) интенсивность лазера» до нуля и «488 интенсивность лазера» до «низкого» (предпочтительно <1%). Отрегулируйте «усиление», чтобы получить хороший динамический диапазон, но не насытить сигнал.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эти значения не являются критическими и используются для обеспечения согласованности. Когда используется лазер на 405 нм, это приведет к увеличению флуоресценции GFP. Чтобы избежать насыщения сигнала во время фотообесцвечивания (шаг 3.11), значение усиления сигнала должно быть уменьшено на зеленый канал. Сильное усиление канала можно оставить на нуле, так как оно не используется для sampling. - Нажмите «Сканировать» в программном интерфейсе, чтобы сканировать почку с помощью лазера 488 нм. Найдите интересующий сегмент, который перпендикулярен траектории луча и хорошо визуализирован с хорошей флуоресценцией GFP. Как только этот регион будет идентифицирован, нарисуйте интересующую область, используя эллиптическую область интереса (ROI).
- Перейдите к «ROI» | «Нарисуйте эллиптический ROI».
ПРИМЕЧАНИЕ. Это будет использоваться для непрерывного измерения средней интенсивности GFP во время фотообесцвечивания, что позволяет вводить точную дозу лазерной обработки.
- Перейдите к «ROI» | «Нарисуйте эллиптический ROI».
- Перейдите в «Вид» | «Элементы управления приобретением» | «Область сканирования C2plus» и выберите «Область сканирования области». В этом интерфейсе появится прямоугольная маска. Вручную определите прямоугольное окно сканирования с помощью курсора ( т.е. перетащите, измените размер и поверните маску), чтобы покрыть сегмент, предназначенный для лазерной абляции. Щелкните правой кнопкой мышиМаску, чтобы принять выбор.
ПРИМЕЧАНИЕ. Отсканируется только выбранная область. - Начните измерение времени, контролируя зеленый канал, используя только 488 нм лазер для активации GFP. Убедитесь, что интенсивность 488-лазера относительно низкая (~ 1%). Измерьте среднюю интенсивность GFP в интересующей области, выбрав «Measure» | «Измерение времени». Используйте вкладки «График» или «Данные», чтобы контролировать средние значения интенсивности в пределах ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ. Скорость сбора определяется временем пребывания пикселя и размером прямоугольного окна, установленным на шаге 3.9, но в целом позволяет быстро отслеживать сигнал (~ 2-10 кадров / с). - Вызвать поврежденные клетки почек фиолетовым лазером (405 нм), увеличив интенсивность до 100%, сдвинув «лазерную мощность» до упора вправо. Лазер 488 нм может оставаться активным, если интенсивность низка.
- Заметим линию gRaph, используя вкладку «График» или числовые значения интенсивности GFP, используя вкладку «Данные», и подождите, пока она не опустится до желаемого уровня, например 50% от базовой линии (как показано на рисунке 1 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Лазер на 20 мВт использовался как часть лазерного блока, на который имеется ссылка (см. Таблицу материалов ); Максимальная интенсивность может различаться между системами. Более низкая интенсивность может быть компенсирована более длительной экспозицией ( т. Е. С использованием процента отбеливания GFP в качестве меры общей экспозиции).
- Заметим линию gRaph, используя вкладку «График» или числовые значения интенсивности GFP, используя вкладку «Данные», и подождите, пока она не опустится до желаемого уровня, например 50% от базовой линии (как показано на рисунке 1 ).
- Как только интенсивность GFP в эллиптическом ROI (шаг 3.8) упадет до желаемого уровня, немедленно уменьшите интенсивность лазера на фиолетовом (405 нм) до «0», перемещая ползунок «лазерная мощность» до упора влево в Панель управления программным обеспечением.
- Получите новый базовый уровень флуоресценции GFP. Подтвердите удаление, получив соотношение X / Y.
ПРИМЕЧАНИЕ. См . Рисунок1B; Y = средняя интенсивность перед абляцией, а X = средняя интенсивность после абляции, с использованием в среднем 4 последовательных выборки в пределах ROI. Точное целевое соотношение (50%, 60% и т . Д.) Зависит от количества травм, которые желательны для данного эксперимента.
- Получите новый базовый уровень флуоресценции GFP. Подтвердите удаление, получив соотношение X / Y.
4. Временная микроскопия с пропидиум-иодидным окрашиванием
- Применять общие временные соображения (описанные в предыдущем исследовании 15 ) для визуализации окрашивания пропидиум йодидом в качестве коррелятора повреждения почек после фотоаблации.
- Предварительно инкубируйте личинок в 30 мкМ раствора пропидия йодида (1% ДМСО в E3-PTU) в течение 3 часов перед встраиванием и фотоаблацией, как описано в шагах 2 и 3.7 соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ. Никакого дополнительного оксида пропидия не требуется в агарозе или растворе для визуализации. - Индуцировать сегментарное повреждение почек, как описано в шагах 3.1-3.12.
- Получайте стопки изображений времени, как descriВ предыдущем исследовании 14 с использованием 488 нм лазера (GFP) и лазера на 461 нм (Propidium Iodide, PI).
ПРИМЕЧАНИЕ. Два цвета накладываются на конфокальные стеки, чтобы коррелировать исчезновение GFP и появление окрашивания пропидиум йодидом. - Задайте параметры для получения стоп-кадров с временным интервалом следующим образом: толщина виртуального среза = 4 мкм, интервал z-стека = 2 мкм, время ожидания пикселя = 1,9 мкс, размеры изображения = 512 x 512 и усреднение = 2.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эти параметры позволяют проводить непрерывную от 10 до 15 минут интервальную запись до 4 личинок и обеспечивать минимальное удаление фотообесцвечивания образца. - Используйте программное обеспечение для обработки изображений, совместимое с форматом файла записи, для визуализации и анализа данных.
- Ориентируйте личинку так, чтобы представляющий интерес сегмент почки был перпендикулярен пути луча, в то время как контралатеральный сегмент находился далеко от лазерного луча (см. Фильм 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обратите внимание, что этот протокол успешно использовался с несколькими трансгенными линиями почки GFP, включая ET (krt8: EGFP) sq1111, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 и Tg (atp1a1a.4: GFP). Примеры, показанные здесь, были получены с использованием линии ET (krt8: EGFP) sq1111.
На рисунке 1 показан пример протокола фотоаблации. Средняя интенсивность GFP контролируется в интересующей области ( рис. 1A и фильм 1 ). Пример средней интенсивности трассировки показан на рисунке 1B .
Как показано на рисунке 2 , после воздействия лазерного излучения 405 нм, флуоресценция GFP продолжает исчезать по одной ячейке за один раз, пока через 220 минут весь абляционный сегмент не потеряет 100% от его положительной реакции GFP. Эта потеря GFP fЛюоресценция действительно обусловлена гибелью клеток, а не, например, снижением регуляции экспрессии GFP. Об этом свидетельствует появление в клетках красных флуоресцентных пропидиум-иодидных клеток, которые теряют положительную реакцию GFP.
Степень гибели клеток можно оценить, измеряя среднюю флуоресценцию GFP в абляционном сегменте и сравнивая ее со средней интенсивностью GFP сразу перед и после отрезка сегмента. На рисунке 3 показана зависимость между степенью лазерной экспозиции (измеренной начальным количеством фотообесцвечивания) и степенью гибели клеток в открытом сегменте. Это показывает, что, изменяя начальную экспозицию, можно «набрать» травму и ответ травмированного эпителия. При 10-20% исходного фотообесцвечивания GFP практически без снижения положительности GFP наблюдается через 5 ч после травмы. 50 и 60% фотообесцвечивания приводят к полному исчезновениюВ то время как 30 и 40% отбеливание приводит к промежуточным результатам, при этом 50% -ная оценка смертности наблюдалась при 35% -ном фотообесцвечивании. Эти результаты поддерживаются окрашиванием PI ( рисунок 3B ). 20% фотообесцвечивание приводит к практически не окрашиванию ПИ на 100 мин после абляции. 50% фотообесцвечивание приводит к непрерывной положительной положительности PI в абляционном эпителии через 60 мин, в то время как 30 и 40% фотообесцвечивания приводит к промежуточному включению PI. Как видно из этих данных, эта методика позволяет индуцировать градуированные количества эпителиального повреждения и для изучения эпителиального ответа на смертельный и сублетальный эпителиальный ущерб.
Рисунок 1: Процедура фотоаблации. ( A ) Схема, показывающая ориентацию эмбриона / личинки, лазерное облучение и область интереса (эллипс) measЗадержка средней флуоресценции для контроля количества фотообесцвечивания GFP; См. Фильм 1. Прямоугольный прямоугольник показывает окно сканирования. ( B ) Пример фактической средней интенсивности интенсивности GFP в области интереса до, во время и после лазерного облучения 405 нм. Средняя интенсивность GFP на четырех последовательных измерениях (показана внутри зеленых ящиков) показана до (Y) и после (X) фотоаблации. Отношение X / Y используется как мера общего светового воздействия и нанесено на ось X на рисунке 3 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Смертность эпителиальных клеток после лазерной экспозиции 405 нм. Пример последовательных кадров, показывающих исчезновение GFPD появление окраски пропидия йодидом после фотоаблации (40% начального фотообесцвечивания). Кадры находятся на 0, 130, 170 и 220 минут после воздействия фиолетового света (405 нм). Исчезновение GFP совпадает с появлением красной флуоресцентной PI ядерной положительности. Обратите внимание, что флуоресценция PrI обнаруживается с использованием красного канала. Красная флуоресценция, наблюдаемая за пределами почки, обусловлена хромофорами и наличием PI в просвете кишечника. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Дозовый ответ эпителиальной травмы на количество фотоаблации. ( A ) Фотоабляция измеряется процентом первоначального снижения флуоресценции GFP в экспозицииСегмент. Это сравнивается со снижением средней флуоресценции GFP в поврежденном сегменте через 5 ч после травмы. Это измерение нормируется на среднее количество флуоресценции вверх и вниз по течению от поврежденного сегмента. Целевые дозы составляли 10, 20, 30, 40, 50 и 60% исходного фотообесцвечивания. Фактические количества немного больше, что составляет 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 и 62,1% фотообесцвечивания, что приводит к остаточной флуоресценции 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 и 37,9%, n = 2 - 6 / группа. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение вдоль X (процент оставшейся флуоресценции сразу после фотобаблирования) и Y (процент оставшейся флуоресценции через 5 часов после фотобаблирования). ( BE ) PI сравнивается с полным исчезновением положительности GFP. Практически нет окрашивания PI наблюдается при 20% (80% оставшейся флуоресценции) фотообесцвечивании при 100-минутной экспозиции после лазера ( B , правая панель). ( C и
| трансгенный | Выражение | Рекомендации |
| Тд (wt1b: GFP) , | Glomerulus, некоторые ПТ | [11] |
| Тд (atp1a1a.4: GFP) , | Дистальный до клубочков | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Дистальный до клубочков | [9,10] |
| Тд (RET1: GFP) , | Поздний DT, PD | [13] |
| Тд (ENPEP: GFP) , | Дистальный до клубочков | [14] |
| Тд (CD41: GFP) , | Многослойные клетки | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | Прямой PT, ранний DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | Сопрягаемый ПТ | [16,17] |
| PT = проксимальная трубка | ||
| DT = дистальная трубка | ||
| PD - Пронефристый канал |
Фильм 1: Краткое описание анимации. В первой части фильма показана правильная ориентация эмбриона / личинки. Две ветви почки показаны зеленым цветом. Стеклянный зонд используется для ориентации рыбы в агарозе. Это делается, если требуется управление, не поврежденная ветвь. Ловля рыбы разрешает лазерное воздействие только на одной ветви почки. Во второй части фильма описывается процедура лазерной абляции. Эллипс указывает область интереса в сегменте, подвергающемся абляции, используемой для контроля количества исходных фотообесцветовХин. Прямоугольное окно позволяет точно регулировать размер и положение аблетированного сегмента. Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Следует отметить, что общая мощность лазера изменяется между системами. Тем не менее, использование процента фотообесцвечивания GFP позволяет считывать полную энергию, подаваемую на флуоресцентную почку, независимо от изменения мощности лазера и компенсируется длительностью воздействия. Имейте в виду, однако, что реакция различных тканей на этот метод фотоабляции меняется. Даже при созревании почек значительно более сложно получить 50% -ное снижение флуоресценции GFP у молодых эмбрионов, чем у зрелых личинок. Эти различия в реакции тканей на фотоаблацию следует учитывать при модификации и адаптации этого протокола к различным приложениям. Таким образом, важно отслеживать процентное снижение флуоресценции GFP, чтобы правильно измерить количество повреждений и прогнозируемый ответ поврежденного эпителия почек.
Основные преимущества этого метода при сравнении других методов повреждения почек вРыбка данио - это то, что позволяет точно контролировать пространственно-временное расположение травмы. Кроме того, он позволяет исследователям набирать уровень травмы вверх и вниз. Эта способность контролировать количество травм должна позволять рассматривать ответы эпителиальных клеток и должна помогать в принятии решений с точки зрения восстановления по сравнению с апоптозом по сравнению с некрозом. Например, можно показать, что миграция клеток представляет собой начальный отклик выжившего эпителия на сегментную абляцию и что пролиферация клеток является вторичным процессом, который, вероятно, обусловлен механическими силами, вызванными миграцией клеток 14 .
Помимо способности изучать процесс ремонта на клеточном уровне, есть и другие преимущества этой методологии. Во-первых, предыдущие методы фотоабляции имели ограниченный контроль над количеством фотодама 9 . Тем не менее, эта модель позволяет градиентно контролировать количество травм, что облегчаетПроводить дальнейшие исследования. Кроме того, при таком подходе можно ориентировать произвольные группы флуоресцентных клеток GFP, что позволяет легко абляцировать целые сегменты. Хотя это может быть достигнуто с помощью импульсной лазерной техники, это более трудоемко, ограничивая потенциал экспериментальной конструкции. Использование GFP для нацеливания и усиления эпителиального повреждения является дополнительным преимуществом, поскольку доступно очень много трансгенного дарителя GFP ( таблица 1 является лишь неполным списком). Также изучались другие флуоресцентные белки, экспрессируемые трансгенными видами, такие как красный белок Killer, но эти трансгенные рыбы не широко доступны 16 . Дополнительным преимуществом использования GFP является то, что при разных длинах волн лазера экспрессия GFP может использоваться либо для фотобаблирования (405 нм), либо для изображения (488 нм). Однако следует отметить, что метод, опубликованный Johnson et al. 9 можно применять к не флуоресцентнымРыбу данио и, следовательно, можно использовать более широко, чем этот подход.
Другим ограничением этой модели лазерной абляции является то, что она не может учитывать все различные факторы, которые могут привести к АКИ человека. Может быть цепочка событий, которые приводят к некрозу клеток в организме человека, а также апоптоз клеток, который индуцируется при повреждении почек. Неясно, могут ли различные среды, возникающие во время лазерной абляции, имитировать все аспекты патофизиологии АКИ у людей 10 . Тем не менее, эта модель лазерной абляции имеет много преимуществ по сравнению с альтернативными моделями. Позволяя исследовать гибель и восстановление клеток почек с высоким разрешением в реальном времени, этот метод должен привести к лучшему пониманию механизмов восстановления почек и заложить основу для новых подходов к лечению АКИ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Иэна Драммонда и доктора Владимира Коржа за распространение трансгенных линий почки GFP. Мы также хотели бы поблагодарить NYITCOM за предоставление необходимых ресурсов для проведения этой работы. Это исследование частично поддерживалось грантами: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) и пилотным грантом HSCI (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
