في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي
Summary
الخلايا العصبية السمعية الدماغية من الطيور والثدييات هي متخصصة في الترميز العصبي السريع، عملية أساسية لوظائف السمع العادية. تنشأ هذه الخلايا العصبية من السلائف متميزة من الدماغ المؤخر الجنيني. نقدم تقنيات الاستفادة إليكتروبوراتيون للتعبير عن الجينات في الدماغ المؤخر من أجنة الدجاج لدراسة وظيفة الجينات خلال التنمية السمعية.
Abstract
إليكتروبوراتيون هو الأسلوب الذي يدخل الجينات ذات الاهتمام في الكائنات ذات الصلة بيولوجيا مثل جنين الدجاج. فمن الثابت منذ فترة طويلة أن الجنين الدجاج هو نموذج بحثي فعال لدراسة الوظائف البيولوجية الأساسية لتطوير النظام السمعي. وفي الآونة الأخيرة، أصبح جنين الدجاج قيمة خاصة في دراسة التعبير الجيني والتنظيم وظيفة المرتبطة السمع. في البيضة إليكتروبوراتيون يمكن استخدامها لاستهداف مناطق الدماغ السمعية المسؤولة عن وظائف السمعية المتخصصة للغاية. وتشمل هذه المناطق نواة الدجاج ماغنوسيلولاريس (نم) ونواة اللاميناريس (نل). نيم و نل الخلايا العصبية تنشأ من السلائف متميزة من رومبوميريز 5 و 6 (R5 / R6). هنا، نقدم في إليكتروبوراتيون البيضة من الجينات ترميز البلازميد لدراسة الخصائص المرتبطة بالجينات في هذه المناطق. نعرض طريقة للتحكم المكاني والزماني للتعبير الجيني التي تعزز إما كسب أو فقدان فينوتيب وظيفيةوفاق. عن طريق استهداف السمعية المناطق السلف العصبية المرتبطة R5 / R6، وتبين لنا ترنسفكأيشن البلازميد في نم و نل. ويمكن تحقيق التنظيم الزمني للتعبير الجيني من خلال اعتماد نظام متجه تيت-أون. هذا هو الإجراء محرض المخدرات التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام في وجود دوكسيسيكلين (دوكس). في تقنية إليكتروبوراتيون البيضة – جنبا إلى جنب مع إما البيوكيميائية، الدوائية، أو في المقايسات الوظيفية في الجسم الحي – يوفر نهجا مبتكرا لدراسة تطوير الخلايا العصبية السمعية والظواهر الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بها.
Introduction
الترميز العصبي السريع من الصوت أمر ضروري لوظائف السمعية العادية. وتشمل هذه القدرات توطين الصوت 1 ، والكلام في التمييز الضوضاء 2 ، وفهم إشارات الاتصال الأخرى ذات الصلة السلوكية 3 . الخلايا العصبية مماثلة تقع في الدماغ السمعي من كل من الطيور والثدييات هي متخصصة للغاية للترميز العصبي السريع 4 . وتشمل هذه نواة الدجاج المغنطيسية (نم)، نامين لاميناريس (نل) ونظيرتها الثدييات، ونواة قوقعة الأذن البطانية (أفن) والزيتون متفوقة وسطي (مسو)، على التوالي 5 . ومع ذلك، فإن الآليات التنموية التي تنظم الترميز العصبي السريع غير مفهومة جيدا في الدماغ السمعي. ولذلك، فمن المفيد لدراسة الجينات المحددة التي هي المسؤولة عن الترميز العصبي السريع من أجل فهم أفضل للتعبير والتنظيم والوظيفة في الاتحاد الافريقيديتوري التنمية.
الجنين الدجاج النامية هو أداة بحث فعالة وراسخة لدراسة المسائل البيولوجية الأساسية لتطوير نظام السمع 6 ، 7 . وقد تناولت التطورات الجزيئية الأخيرة هذه المسائل البيولوجية في الجنين الدجاج النامية من خلال التعبير عن أو طرق أسفل الجينات ذات الاهتمام من أجل تحليل في الجسم الحي وظيفة الجينات 8 ، 9 . إن التحقيق في الدور التنظيمي لجينات معينة هو تقدم كبير في فهم الأمراض المرتبطة بالعجز السمعي. هنا، نقدم في إليكتروبوراتيون البيضة من الجينات ترميز البلازميد في الدماغ الدماغ السمعي حيث الترميز العصبي السريع من الصوت يحدث 10 . من خلال استهداف السمعية المناطق السلف العصبية المرتبطة رومبوميريز 5 و 6 11 و 12 (R5 /R6)، وتبين لنا السيطرة المكانية من ترنسفكأيشن البلازميد في نم و نل. وبالإضافة إلى ذلك، نظهر التنظيم الزمني للتعبير عن طريق اعتماد نظام ناقلات تيت على. هذا هو الإجراء محرض المخدرات التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام في وجود دوكسيسيكلين (دوكس) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
في إليكتروبوراتيون البيضة هو وسيلة للتعبير عن أو طرق أسفل الجينات ذات الاهتمام من أجل تحليل في الجسم الحي وظيفة الجينات 8 ، 9 . في جنين الدجاج، بل هو طريقة مبتكرة للتعبير عن الجينات ترميز البلازميد في مختلف مناطق الدماغ ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر درس. ليزلان شيكتيرسون، يوان وانغ، أندريس بريا والسيدة زيمينا أوبتيز-أرايا للمساعدة الأولية في إعداد البروتوكول وتوفير البلازميدات. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيدسد منحة DC013841 (جتس).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
