Een methode om het effect van milieueisen op paring gedrag in te testen<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
We analyseren een analyse om de milieu- en genetische signalen te analyseren die invloed hebben op paringsgedrag in de vruchtvlieg Drosophila melanogaster .
Abstract
De seksuele aandrijving van een individu wordt beïnvloed door genotype, ervaring en milieuomstandigheden. Hoe deze factoren elkaar interpreteren om seksueel gedrag te moduleren, blijven slecht begrepen. In Drosophila melanogaster beïnvloeden milieuechnieken, zoals beschikbaarheid van voedsel, paring, die een tracteerbaar systeem biedt om de mechanismen te onderzoeken die seksueel gedrag moduleren. In D. melanogaster worden milieuechnieken vaak genoteerd via de chemosensorische damp- en olfactorische systemen. Hier presenteren we een methode om het effect van milieuchemische signalen op paring gedrag te testen. De test bestaat uit een kleine paring arena met voedingsmedium en een parenpar. De paringsfrequentie van elk koppel wordt 24 uur per dag gecontroleerd. Hier presenteren we de toepasbaarheid van deze test om milieuverbindingen uit een externe bron te testen via een persluchtsysteem, evenals manipulatie van de milieukomponenten direct in de parkeerplaats. De uHet zien van een luchtdruksysteem met drukwerk is bijzonder nuttig om het effect van zeer vluchtige verbindingen te testen, terwijl het direct manipuleren van componenten in de paringsarena van waarde kan zijn om de aanwezigheid van een verbinding te bepalen. Deze analyse kan worden aangepast om vragen te beantwoorden over de invloed van genetische en milieueisen op paringsgedrag en fecunditeit, evenals ander mannelijk en vrouwelijk voortplantingsgedrag.
Introduction
Reproductieve gedragingen hebben meestal hoge energiekosten, vooral voor vrouwen, die grotere gameten produceren dan mannen en moeten zorgvuldig de voorwaarden kiezen om hun ontwikkelende nakomelingen te verhogen. Vanwege de energiekosten is het niet verwonderlijk dat reproductie verbonden is met voedingsomstandigheden. Dit geldt bij de meeste, zo niet alle dieren, waaronder zoogdieren, waarvan de puberteit kan worden vertraagd door ondervoeding, en wiens seksuele aandrijving negatief kan worden beïnvloed door voedselbeperking 1 .
De reproductie van het genetisch model organisme Drosophila melanogaster wordt ook beïnvloed door voedingsomstandigheden. Mannelijk hof op hoger niveau in aanwezigheid van voedsel vluchtige stoffen 2 , en vrouwtjes zijn meer seksueel ontvankelijk in aanwezigheid van gist, een belangrijke voedingsstof voor eierproductie en nakomelingen 3 , 4 , 5 . DezeEvolutionaire geconserveerde voortplantingsrespons op voedsel biedt de mogelijkheid mechanismen te bestuderen die de beschikbaarheid van voedsel voor het milieu verbinden met seksuele voortplanting in een genetisch tracteerbaar en tijd-efficiënt organisme. Inderdaad, werk in D. melanogaster heeft de insulineweg betrokken als een belangrijke regelaar van de verband tussen voedsel en paringsgedrag 6 . Het heeft ook aangetoond dat de daad van paring zelf de voedselvoorkeur van vrouwen verandert, evenals de bijbehorende chemosensorische neuronen 7 , 8 , 9 .
Het is duidelijk dat voedselaanwijzingen het voortplantingsgedrag beïnvloeden in D. melanogaster . Deze effecten lijken vooral te beïnvloeden vrouwen, met name degenen die al 5 hebben gemoeid. Om deze acute effecten van milieuomstandigheden te testen, kan de analyse die klassiek gebruikt wordt voor vrouwelijk paringsgedrag echterNiet erg geschikt als gevolg van de lange onderbrekingen tussen paringsafspraken. In de klassieke herhalende test, maagd een maagdvrouw eerst met een mannetje, en wordt onmiddellijk geïsoleerd en gepresenteerd met een nieuw mannetje 24 tot 48 uur later. Deze klassieke test is met groot succes gebruikt om componenten van het mannelijke ejaculaat te identificeren die het vrouwelijke gedrag en de vrouwelijke respons 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 veranderen . De doorlopende paringstest die hier wordt aangetoond, is dus een aanvulling op klassieke paringsbepalingen die kunnen worden gebruikt om het acute effect van milieuomstandigheden op het voortplantingsgedrag te bestuderen.
Met behulp van de continue analyse voor paringsgedrag die hier wordt uitgelegd, hebben we eerder aangetoond dat een paar vliegen die blootgesteld zijn aan gist, sEeuwige tijden over een 24 uur observatieperiode 5 , 19 , 20 , 21 , terwijl vliegen die niet aan voedsel blootgesteld worden, zal slechts een keer 5 herstellen. Deze bevinding kan puzzelend zijn in het licht van een groot deel van de D. melanogaster literatuur die aangeeft dat vrouwen niet meerdere dagen na een eerste paring remitten (in referenties 10 , 11 onderzocht). Deze discrepantie kan echter gemakkelijk worden verklaard door testomstandigheden, waarbij een vrouw voor een tot meerdere dagen wordt geïsoleerde voordat er een nieuwe paringsgevoel wordt aangeboden. Als het paar niet in deze uurlange observatietijd voldoet, wordt het vrouwtje niet beschouwd als ontvankelijk. Bovendien moet de hoge paringsfrequentie niet verrassend zijn, aangezien de gegevens van wild gevangen vliegen aantonen dat vrouwtjes sperma bevatten van 4 tot 6 mannen in hun opslagorganen; Dus inDiceren dat vrouwtjes natuurlijk meerdere malen 22 , 23 remmen.
Hier demonstreren wij het gebruik van deze continue paring test om te ontrafelen hoe vliegen verzamelen en combineren van informatie over milieuomstandigheden om de paringsfrequentie te moduleren. Deze test maakt het mogelijk om een relatief groot aantal parende paren te testen voor genetische studies en om de invloed van vluchtige en niet-vluchtige milieubeelden te testen. De test loopt typisch 24 uur, maar kan worden uitgebreid tot 48 uur, waardoor het testen van cyclische milieubeelden zoals de lichtdonkere (LD) cyclus mogelijk is. We tonen deze analyse aan door de invloed van vluchtige signalen uit een gistcultuur in een drukluchtsysteem te testen in combinatie met de beschikbaarheid van niet-vluchtige gistvoedingstof in het voedingssubstraat.
Het perslucht systeem pompt voortdurend vluchtige signalen in een parkeerplaats die bevatEen voedingssubstraat en een testpaar (waarvan het paringsgedrag wordt gecontroleerd). Om verder te bepalen welke specifieke eigenschappen gist beïnvloedt, testen we een belangrijke vluchtige verbinding van gist, namelijk azijnzuur 24 , in combinatie met een aminozuurgehalte dat overeenkomt met die van gist in het voedingssubstraat, in de vorm van pepton (amino Zuren afgeleid van enzymatische vertering van dierlijke eiwitten). Samen tonen deze experimenten aan hoe het effect van milieu-signalen op het paringsgedrag van D. melanogaster met deze test kan worden getest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een test om het 24-uurse gedragsgedrag te testen, terwijl de milieu-signalen voortdurend worden gecontroleerd dat een parenpar wordt verondersteld om te gebruiken om de paringsfrequentie te bepalen. Het is mogelijk om de paringsfrequentie te verhogen in reactie op gistlucht die via een persluchtsysteem wordt geleverd wanneer het medium ook gist bevat ( Figuur 2B ). Bovendien kan een soortgelijk antwoord in paringsfrequentie worden waargenomen met een vereenvoudigd voedingsmedium …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Bloomington Drosophila Stock Center voor de vliegvoorraden; C. Gahr, JT Alkema en S. van Hasselt voor hun vroege poging tot het ontwikkelen van de luchtdrukonderzoek; Jasper Bosman voor advies over het cultiveren van gist; En Rezza Azanchi en Joel Levine voor het oorspronkelijk ontwikkelen van de time-lapse monitoring van Drosophila paring gedrag. JA Gorter werd gesteund door een subsidie van de Neuroscience Research School BCN / NWO. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (referentie: 821.02.020) aan JC Billeter.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
