Summary

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen<em> Drosophila melanogaster</em

Published: July 17, 2017
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Summary

Wir zeigen einen Assay, um die ökologischen und genetischen Cues zu analysieren, die das Paarungsverhalten in der Fruchtfliege beeinflussen Drosophila melanogaster .

Abstract

Der sexuelle Antrieb eines Individuums wird durch Genotyp, Erfahrung und Umweltbedingungen beeinflusst. Wie diese Faktoren interagieren, um sexuelle Verhaltensweisen zu modulieren, bleibt schlecht verstanden. In Drosophila Melanogaster , Umwelt-Cues, wie die Verfügbarkeit der Lebensmittel, beeinflussen Paarung Aktivität bietet ein traktierbares System, um die Mechanismen zu modulieren sexuelles Verhalten zu untersuchen. In D. melanogaster werden ökologische Hinweise oft über die chemosensorischen Geschmacks- und Geruchsstoffe erkannt. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Wirkung von umweltchemischen Stichworten auf das Paarungsverhalten zu testen. Der Assay besteht aus einer kleinen Paarungsarena mit Nahrungsmedium und einem Paarungspaar. Die Paarungsfrequenz für jedes Paar wird kontinuierlich für 24 Stunden überwacht. Hier stellen wir die Anwendbarkeit dieses Assays dar, um Umgebungsverbindungen aus einer externen Quelle durch ein Druckluftsystem zu testen und die Umweltkomponenten direkt in der Paarungsarena zu manipulieren. Das UEin Druckluftsystem ist besonders nützlich, um die Wirkung von sehr flüchtigen Verbindungen zu testen, während die Manipulation von Komponenten direkt in der Paarungsarena von Wert sein kann, um die Anwesenheit einer Verbindung zu ermitteln. Dieser Assay kann angepasst werden, um Fragen über den Einfluss von genetischen und ökologischen Cues auf Paarungsverhalten und Fruchtbarkeit sowie andere männliche und weibliche Fortpflanzungsverhalten zu beantworten.

Introduction

Fortpflanzungsverhalten haben typischerweise hohe Energiekosten, vor allem für Frauen, die größere Gameten produzieren als Männer und müssen sorgfältig die Bedingungen wählen, um ihre sich entwickelnden Nachkommen zu erhöhen. Wegen der Energiekosten ist es nicht verwunderlich, dass die Reproduktion mit den Ernährungsbedingungen verbunden ist. Dies gilt in den meisten, wenn nicht alle Tiere , einschließlich Säugetiere, deren Pubertät durch Unterernährung verzögert werden kann und Sexualtrieb , dessen kann sich negativ durch Nahrungsbeschränkung 1 betroffen sein.

Die Reproduktion des genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster wird auch durch Ernährungsbedingungen beeinflusst. Males Gericht auf höherem Niveau in Gegenwart von Lebensmitteln flüchtige 2 , und Frauen sind mehr sexuell empfänglich in Gegenwart von Hefe, ein wichtiger Nährstoff für die Eiproduktion und Nachkommen Überleben 3 , 4 , 5 . DiesEvolutionäre konservierte Reproduktionsreaktion auf Nahrung bietet die Möglichkeit, Mechanismen zu untersuchen, die die Umweltnahrungsmittelverfügbarkeit mit der sexuellen Reproduktion in einem genetisch tragbaren und zeitsparenden Organismus verbinden. In der Tat hat die Arbeit in D. melanogaster den Insulinweg als wichtigen Regulator des Zusammenhangs zwischen Nahrung und Paarungsverhalten verwickelt 6 . Es hat auch gezeigt, dass der Akt der Paarung selbst die Nahrungspräferenz von Weibchen sowie die damit verbundenen chemosensorischen Neuronen 7 , 8 , 9 ändert.

Es ist klar, dass Lebensmittel-Cues Reproduktionsverhalten in D. melanogaster beeinflussen . Diese Effekte scheinen vor allem Frauen zu behandeln, speziell diejenigen, die bereits gepaart haben 5 . Um jedoch diese akuten Effekte von Umgebungsbedingungen zu testen, kann der Assay, der klassisch für weibliches Paarungsverhalten verwendet wird,Nicht sehr geeignet wegen der langen Unterbrechungen zwischen Paarung Episoden. In der klassischen Remoting-Assay, eine Jungfrau weiblich erste Kumpel mit einem Mann, und ist sofort isoliert und präsentiert mit einem neuen Mann 24 bis 48 Stunden später. Dieser klassische Assay wurde mit großem Erfolg verwendet, um Komponenten des männlichen Ejakulats zu identifizieren, die das weibliche Verhalten und die weibliche Antwort 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 modifizieren. Der hier vorgestellte kontinuierliche Paarungsassay ist daher eine Ergänzung zu klassischen Paarungsassays, mit denen die akute Wirkung von Umgebungsbedingungen auf das Fortpflanzungsverhalten untersucht werden kann.

Mit dem kontinuierlichen Assay für das Paarungsverhalten, das hier erklärt wird, haben wir vorher gezeigt, dass ein Paar Fliegen, die Hefe ausgesetzt sind, sAlltägliche Zeiten über einen 24-Stunden-Beobachtungszeitraum 5 , 19 , 20 , 21 , während Fliegen, die nicht der Nahrung ausgesetzt sind, nur einmal 5 Dieser Befund kann im Lichte eines großen Teils der D. melanogaster- Literatur rätselhaft sein, was darauf hinweist, dass Frauen sich nach einer anfänglichen Paarung (einige in den Ziffern 10 , 11 ) nicht wiederholen. Allerdings kann diese Diskrepanz leicht durch Assay-Bedingungen erklärt werden, wo eine Frau für ein bis mehrere Tage isoliert ist, bevor eine neue Paarungsmöglichkeit zur Verfügung gestellt wird. Wenn das Paar in dieser stundenlangen Beobachtungsperiode nicht passt, wird das Weibchen als nicht empfänglich charakterisiert. Darüber hinaus sollte die hohe Paarungsfrequenz nicht überraschen, da die Daten von wild gefangenen Fliegen zeigen, dass Frauen Spermien von 4 bis 6 Männchen in ihren Speicherorganen enthalten; Also inDass Frauen selbstverständlich mehrmals 22 , 23 .

Hier zeigen wir die Verwendung dieses kontinuierlichen zusammenpassenden Assays, um zu enträtseln, wie Fliegen sammeln und kombinieren Informationen über Umgebungsbedingungen, um Paarungsfrequenz zu modulieren. Dieser Assay erlaubt es, eine relativ große Anzahl von Paarungspaaren für genetische Studien zu testen und den Einfluss von flüchtigen und nicht-flüchtigen Umwelt-Cues zu testen. Der Assay läuft typischerweise für 24 h, kann aber auf 48 h verlängert werden, was die Prüfung von Zyklus-Umgebungs-Cues wie dem Hell-Dunkel-Zyklus ermöglicht. Wir zeigen diesen Assay, indem wir den Einfluss von flüchtigen Cues aus einer Hefekultur innerhalb eines Druckluftsystems in Kombination mit der Verfügbarkeit von nicht-flüchtigen Hefe-Nährstoffen in dem Nahrungsmittelsubstrat untersuchen.

Das Druckluftsystem pumpt kontinuierlich flüchtige Cues in eine passende Arena, die enthaltenSa-Food-Substrat und ein Test-Paar (dessen Paarungsverhalten überwacht wird). Um die Besonderheiten, durch die die Hefe beeinflusst, zu bestimmen, testen wir eine große flüchtige Verbindung von Hefe, nämlich Essigsäure 24 , in Kombination mit einem Aminosäuregehalt, der dem von Hefe im Nahrungsmittelsubstrat entspricht, in Form von Pepton (Amino Säuren, die aus der enzymatischen Verdauung von tierischen Proteinen gewonnen wurden). Gemeinsam zeigen diese Experimente, wie die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten von D. melanogaster mit diesem Assay getestet werden kann.

Protocol

1. Umweltgesteuerte Paarungsbox Um eine kontrollierte und leicht zu reinigende Testfläche zu gewährleisten, richten Sie einen Edelstahl-Küchenschrank von 120 cm x 64 cm x 85 cm ein, wie in Abbildung 1A dargestellt. Bohren Sie ein Loch an der Rückseite des Schrankes knapp unter der Decke und vier Sätze von vier Löcher in die Seiten, jeweils mit einem Durchmesser von 2 cm. Bohren Sie die ersten beiden Sätze von vier Löchern, auf jeder Seite des Kastens in einer Höhe von 7 cm v…

Representative Results

Mit diesem kontinuierlichen Assay, Paarungsverhalten und Paarungsfrequenz im spezifischen, kann unter experimentellen Umgebungsbedingungen bestimmt werden. Um die Umgebungsbedingungen zu kontrollieren, haben wir einen Edelstahl-Küchenschrank in einen Testbereich mit eigener Lichtquelle und Diffusion verwandelt, der eine hohe Lichtmenge und eine minimale Blendung von der Oberseite der Paarungsarenen gewährleistet ( Abbildung 1A ) . Der innere Testbereich ist komplett au…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay, um das Paarungsverhalten über 24 h zu testen, während kontinuierlich die Umgebungsbedürfnisse kontrolliert werden, dass ein Paarungspaar hypothetisch verwendet wird, um die Paarungsfrequenz zu bestimmen. Es ist möglich, die Gegenfrequenz in Reaktion auf Hefeluft zu erhöhen, die durch ein Druckluftsystem zugeführt wird, wenn das Medium auch Hefe enthält ( 2B ). Zusätzlich kann eine ähnliche Antwort in der Paarungsfrequenz mit einem vereinfachten Nahrungsm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände; C. Gahr, JT Alkema und S. van Hasselt für ihren frühen Versuch, den Druckluft-Assay zu entwickeln; Jasper Bosman für den Rat zum Anbau von Hefe; Und Rezza Azanchi und Joel Levine für die ursprüngliche Entwicklung der Zeitraffer-Überwachung von Drosophila Paarung Verhalten. JA Gorter wurde von einer Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program Grant unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Referenz: 821.02.020) an JC Billeter unterstützt.

Materials

Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25×95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

References

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Cite This Article
Gorter, J. A., Billeter, J. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

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