Summary
生後に一側内頚動脈閉塞を行った 7 10 CD-1 マウス新生児低酸素性虚血性 (HI) モデルを作成する子犬とこんにちは脳損傷の効果を検討しました。非運営正常なマウスと比較してこれらのマウスの神経行動学的機能を検討した.
Abstract
CD-1 マウス新生児低酸素性虚血性 (HI) モデルを作成するに一側内頚動脈閉塞を実施し、に比べて非操作 (つまり、これらのマウスの神経行動学的機能を研究することによって新生児こんにちは脳損傷の効果を調査通常の) マウス。調査中, 米ヴァンヌッチ メソッドは生後 7-10 (P7-10) マウスの新生児のこんにちは脳の損傷を誘導するために使用されました。こんにちは操作は、一方的な頚動脈結紮と低酸素症 (8% O2と 90 分の 92% N2 ) への露出によって、子犬に実行されました。術後、1 週間破損した脳半透明頭蓋骨を通して肉眼で評価され、不在 (「大脳皮質損傷なし」グループ) や大脳皮質損傷の存在 (「大脳皮質損傷」グループ) に基づくサブグループに分類されました。など右半球の病変。週 6、認知・運動機能を評価する以下の神経行動学的検査を行った: 受動的回避反応タスク (PAT)、はしご歩行テスト、およびグリップ強度テスト。これらの行動テスト新生児こんにちは脳損傷の影響を決定する上で有用ですが、その他の神経変性疾患のマウス ・ モデルで使用されます。本研究では、新生児こんにちは脳損傷マウスは右半球損傷に対応したモーターの赤字を示した。行動テスト結果、脳性麻痺または新生児脳梗塞など、人間の新生児こんにちは患者にみられる欠損に関連します。この研究では、新生児のこんにちは脳損傷のマウス モデルは運動障害と非操作マウスに比べて認知障害の程度が異なるを示したおよび設立されました。この作品は、こんにちマウス モデルの基本情報を説明します。MRI 画像は、運動と認知機能テストで脳の損傷の重症度に応じて区切られた異なる表現型を示しています。
Introduction
幼い頃 (約 1,000 人の子供あたりの 2 人の患者)1,2,3,4,5中に新生児のこんにちは脳損傷が発生します。新生児こんにちは脳損傷に関する研究が重要であり、確立された新生児こんにちは脳損傷マウス モデルを用いた体内こんにちは脳損傷の臨床研究を促進できます。
ラット6従来の HI モデルが使用されます。新生児モデルの米ヴァンヌッチ メソッドは P7 ラット7,8よく使用されます。ただし、ラットおよびマウスなのでわずかに異なる9,10、にもかかわらず両方の齧歯動物を行った修正米ヴァンヌッチ法 P7-10 P7 10 ある期間であることを示した前の研究を基に CD 1 子犬の特徴未熟なオリゴデンドロ サイト、人間用語 P011,12に対応します。新生児のこんにちのマウスモデルは P7 10 子犬の両方一側内頚動脈の結紮とマウスの 8% の酸素と低酸素への露出によって確立されます。
マウス右半球の後外側領域にさまざまな脳の病変の程度を示したプロシージャに服従します。認知およびモーター欠損、PAT に基づく神経行動学的評価を識別し、はしごの歩行テスト、およびグリップ強度テストを行った。非運営 (すなわち、通常) とこんにちはマウスとの違いを分析しました。この作品は、HI マウス モデルに関する基本的な情報を示します。MRI 画像は、運動と認知機能テストを使用して脳の損傷の重症度に応じて、分離、異なった表現型を示しています。
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Protocol
すべての動物施設評価認定の研究所動物ケア (AAALAC) 協会の認定を受けて、食べ物を与えられる (27 × 22.5 × 14 cm3) 標準的な檻の中で収容され、水を交互に 12 h/暗下で自由サイクル。著者動物保護の規則に従い、実験手順が承認された機関動物ケアおよび使用委員会の延世大学医科大学 (IACUC 号 2010-0252; 2013-0220)。
1. こんにちは新生児の脳損傷マウスモデル
- イソフルランと子犬を麻酔します。
- 子犬 (5 未満) を麻酔ボックスに置き、ふたを閉じる。
- 約 15 分間; 麻酔を入れますガスとイソフルラン テーブル トップ麻酔機を使用して調整します。1.5 L/分調整麻酔導入の 3-5% にイソフルラン気化器に酸素流量を調整します。
- 15 分後に麻酔の維持のための 1-2% にイソフルラン気化器を調整します。
- 解剖顕微鏡 (研究者に直面して腹部) の下で完全に麻酔をかけられた子犬を置き、テープで固定します。
- 滅菌はさみを使って首で ~0.7-mm 切開を行います。
- 慎重に滅菌鉗子を使用して脂肪組織を除去し、一方的な右頸動脈を公開します。
- 5-0 吸収性縫合糸で一方的な右頚動脈を結紮します。
- 5-0 縫合糸で首の切開部を縫合します。
- 回復の 1 h に 37 ° C の暖かい低酸素室の中には、それぞれの子犬を配置します。商工会議所のふたは閉じないでください。
- 手術後 1 h 子犬が完全に目を覚まし、低酸素室蓋を閉じるし、(8% O2と 92% N2) 低酸素の条件を確立するガスのレベルを減少させます。
- 低酸素の 90 分後、子犬をケージに戻ります。
- こんにちは脳損傷後 1 週間は、手順 1 を繰り返します。
- 麻酔後滅菌ハサミ鉗子右半球の後外側領域に脳の病変を識別すると、頭皮の切開を行います。
注: この治療は仔ラットの低酸素症を誘発します。存在とすべてのマウスにおける脳損傷の程度は、半透明頭蓋骨を通して肉眼で視覚的に評価されます。サイズまたは変色 (すなわち、脳障害) のボリュームにより、子犬はグループに分類されます。表示される大脳皮質損傷がない場合マウスは「大脳皮質損傷なし」グループに分類されます。可視皮質障害 (すなわち、右半球の病変) がある場合、マウスは「大脳皮質損傷」グループに分類されます。脳サンプルの形態が犠牲1,2,3の時に明確に定義されている場合、グループを変更できるマウスのグループへの分類は、術後後 1 週間を行われる、ので 4。
- 麻酔後滅菌ハサミ鉗子右半球の後外側領域に脳の病変を識別すると、頭皮の切開を行います。
図 1: マウスの新生児のこんにちは脳損傷のモデル化。
(A) 7 日齢マウスの子犬が手術し、片側右頚動脈を結紮します。(B) 子犬は 8% O2と 92% N2で 90 分に低酸素室の中に置かれました。(C、D、および E)新生児こんにちは外傷による脳損傷の様々 な重症度を示したし、損傷の程度に基づいて分類されました。14 日に脳を入手し、病変が, 可視化されました。(C)、「ない皮質損傷」に分類される脳のイメージ。両方 (D) および (E)「大脳皮質損傷」グループに分類されました。(F、G、および H)(C) の代表的な MRI (D) および (E) マウス、それぞれ。(F) 海馬での被害は、黄色の矢印で示され、右半球の病変も (G および H) の黄色の矢印で示されます。スケール バー 1 mm =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. 新生児の行動テスト
注: ここでは、行動のテストは、6 週齢で行われました。
-
受動的回避反応タスク。
注: 学習と嫌悪刺激の回避に基づくメモリ関数を評価するには、パット ステップ 2 コンパートメントは実施13,14,15,16をする必要があります。- パット装置のプレキシ ガラス シャトル ボックス (41.5 × 21 × 35 cm3) の明るい区画にマウスを配置します。
- 後 30 秒、ギロチン ドアを開き、暗い区画に移動するマウスの遅延時間を記録 (最大 300 s)。
- マウスのすべての 4 つの手足が完全に暗い室内は、ギロチンのドアを閉じます。
- 電気フット ショックを管理 (0.5 mA) 2 s と檻に戻るマウス。
- 電気フット ショック後明るい区画 24 h でマウスを交換してください。
- 完全に明るい区画に配置した後マウス ギロチン ドア 10 s を開き、暗い区画に移動するマウスの遅延時間を記録 (最大 300 s)。
-
歩行テストをはしご。
注: はしごラング歩行タスクで質的な組み合わせることにより運動機能の微妙な障害および熟練した歩行17,18の定量分析とを区別できます。- ビデオ カメラをオンにします。
- はしごのスタート パネルにマウスを置き、すぐに録音を開始します。
- マウスの肢に焦点を当て、映像を記録します。
- マウスに触れるはしごの最後のパネルの記録を停止します。行ったり来たりの旅を 4 回繰り返します。
- ビデオの記録を分析し、手動で次のように各前肢の伝票の数をカウントします。
- 低速のコンピューター上のビデオの録画 (0.1 x) と手動での手順をカウントします。
-
グリップ強度テスト。
メモ: グリップ強度テストはプッシュプル ゲージを含むグリップ強度メーターを使用して実行されます。- アクリル パネルにグリップ力装置を修正します。
- アクリル パネルにマウスを置き、しっぽを保持します。
- マウスがアクセスできるように、尾を持っている手とグリップ装置の金属の線を移動します。
- マウス グリップ金属ワイヤ (直径 2 mm); 三角形部分まで、複数の試験を許可します。ピーク力はグラムに装置によって自動的に登録されます。
注: 分析19,20,21の 3 つの試験の平均ピーク力を使用します。
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Representative Results
すべてのデータは、平均値 (SEM) の平均 ± 標準誤差として表されます。独立した、またはtを使用して 2 つのグループ間の変数の比較を行った-SPSS の統計ソフトウェアのテストします。P-値 < 0.05 は、統計的に有意と考えられていた。
新生児こんにちは外傷による脳損傷の別の重要度を示したし、それに応じて分類された (図 1E)。脳が、14 週で得られたし、病変が, 可視化されました。図 1は、脳の「大脳皮質損傷ない」脳、図 1のように分類、軽症に分類される脳、図 1E損傷脳を示していますを示しています。軽度の (D) と (E) 重度の損傷は、「大脳皮質損傷」グループに分類されました。こんにちは術後後 13 週齢のマウスをイメージしました MRI を使用して、結果 (図 1 階H) は (C) の代表的なイメージ (D) および (E) 傷害、それぞれ。にもかかわらず、脳の形態になかった重要な病変は、MRI 画像は海馬傷害 (図 1 f) を示した。(図 1 階、黄色の矢印で示されます) 海馬に破損している少し穏やかに傷つけられた頭脳の。重度の損傷した脳では、マウスは、右半球 (図 1と H の黄色の矢印で示されます) のほとんどを失った。
こんにち損傷脳海馬傷害 (図 1 階H) を示したので HI 損傷マウスは赤字が普通のマウスに比べてメモリを示した。パットの性能は密接に関連する海馬損傷13,15,16,19です。図 2は、パットで評価した HI 損傷マウスが13通常のマウスよりもより多くの認知障害を持っていたことを示しています (通常 n = 10;こんにちは n = 9)。図 2 aに示すように、ベースラインと正常なマウスで 24 h メモリ テスト間統計的に有意な差が認められた (*p = 0.003 ペアtに基づいて-テスト)。図 2B表示認知の変化機能こんにち傷害マウスに比べて通常のマウス (デルタ (Δ) はベースラインと 24 h テストの違い)13。
右半球だけが破損したので、新生児のこんにちは脳損傷マウスは脳卒中片麻痺の運動機能を示した。各前肢で撮影の手順の合計数を基準にして梯子の横段のスリップの割合の違いは、新生児こんにちは脳損傷マウス17,19と正常なマウスを比較に使用されました。図 3に示すこんにちは脳損傷マウスにおける対側の前肢のスリップ率は通常のマウスよりも有意に高かった (通常 n = 19;こんにちは n = 18。*p =0.010 独立tに基づいて-テスト)22、しかし、ないの違いは同側の前肢で観察された(p = 独立したtに基づく 0.798-テスト)。
また、グリップの強さには、脳の運動野が含まれているので、通常皮質損傷群はグリップ力の違いを示した。グリップの強さから結果が、通常、大脳皮質損傷マウスではない差は認めない (図 4 a; 通常 n = 4; ない大脳皮質損傷 n = 12)、グラフが対側の前肢のグリップ力が大幅だったことを示して通常のマウスよりも大脳皮質損傷マウスで弱い (図 4 b; 通常 n = 4; 大脳皮質損傷 n = 36; *p = 独立したtに基づく 0.036-テスト)21,22,23。
図 2: 新生児こんにちは脳損傷、正常マウス パット。
(A) 明るい区画内の待ち時間だった測定し、新生児こんにちは脳損傷と正常なマウスと比較 (n = 9 と n 10 をそれぞれ =)。(電子衝撃の瞬間に B) の測定は、ベースラインを考慮され、長期記憶は、電気ショック後 24 時間を評価しました。デルタ (Δ) 24 h 待機時間 24 h、ベースライン評価関数の違いがあった。p< 0.05;すべてのデータは、平均 ± SEM. として表現されるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 前肢すべり速度の歩行実験のはしご。
対側と同側の前肢のスリップ率が通常こんにちは脳損傷マウスと評価した (n = 19 と n 18 をそれぞれ =)。p< 0.05;すべてのデータは、平均 ± SEM. として表現されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: グリップ強度試験新生児こんにちは脳損傷と正常なマウス。
対側の前肢のグリップ力が評価され、 (A)通常、いいえ皮質損傷と (B) 大脳皮質損傷マウス比較 (n = 4, n = 12, n = 36)。*p< 0.05;すべてのデータは、平均 ± SEM. として表現されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、HI P7 10 CD-1 マウスの新生児脳障害し、関連する認知およびモーター欠損で脳障害を識別しました。この中に、片側の右頚動脈の閉塞は重要でした。この手順で動脈を破損し、破れたでした。動脈涙を経験したほとんどの子犬が死亡しました。逆に、研究者は、一方的な右頚動脈ではなく別の血液静脈を結紮、子犬の脳は少しだけ破損しているし、重要な表現が認められなかった24。
マウスと性病変の容積、脳の変化のため、本研究ではいくつかのグループ (図 1 C H) に分類されました。軽度の負傷した頭脳を持ついくつかのマウスは、海馬と皮質領域 (図 1 f)13のない被害を受けた。逆に、右半球と皮質のほとんどを失ったが厳しくひどく傷つけられた頭脳を持ついくつかのマウスには、(図 1 と H) が破損しています。したがって、研究する必要があります手順19,25後 1 週間、病変の大きさを識別します。脳を MRI スキャン、評価されたので、体積の測定と病変の大きさがより信頼性の高いでした。したがって、肉眼で目視検査も可能ですが、研究者が、MRI を用いた脳を評価することをお勧めします。
脳性麻痺は、約 1,000 人の子供の5あたり 2 人の患者の罹患率と、幼児期早期に通常発生します。脳性麻痺に関する臨床研究の本研究からベースライン情報を使用ことができます新生児こんにちマウス モデルでは、脳性麻痺または新生児ストローク4,11,26の代表的なモデルを使用できます、のでや新生児のストローク。
神経行動学的評価、認知およびモーター欠損13の表現型を識別するために便利です。本研究で導入神経行動学的評価、適応も、その他神経変性疾患、ハンチントン病、パーキンソン病のなど、よく使用される、などなど。研究者は、パット中、科目が電気ショックを受けることに注意してくださいする必要があります。したがって、パットは、最後に、電気ショックに他の行動の評価は影響しませんのでに実行する必要があります。
さらなる研究は、研究者は研究 HI グループと比較して偽運営グループ必要があります。特定のコントロール グループの研究者は首に切開を確認でき、動脈結紮せず切開を閉じる。こんにちは操作を模倣するには、これらの子犬すべき低酸素症、低酸素室になく HI グループとして檻に戻される前に時間の同量のため。
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Disclosures
著者は競合する興味を持ってないです。
Acknowledgments
この研究は、国立研究財団 (NRF 2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068)、科学省と技術、韓国、韓国健康技術 R & D プロジェクト (HI16C1012)、厚生労働省からの助成金によって支えられた &福祉・韓国・延世大学医学 (6-2016-0126) の「東和」学部研究支援プログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxic chamber | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| PAT apparatus | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| The ladder rung walking | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| SDI Grip Strength System | San Diego Instruments Inc. | ||
| Grip-Strength Meter | Ugo Basile | 47200 | |
| Harvard Apparatus Fluovac anesthetizing system | Harvard Apparatus | ||
| Anesthetizing box | acryl box | ||
| I-Fran Liquid (Isofluorane) | Hana Pharm. Co., Ltd. | General Anesthetics ( isoflurane 100ml) | |
| CD-1 mice | Orient Co., Ltd. | ||
| Blue Nylon Mono Non-Absorbbable suture 5-0 50cm | Ailee Co., Ltd. | NB 521 | |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Ver. 23 |
References
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