Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering
Summary
Een modulaire benadering van de synthese van N– glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.
Abstract
We presenteren een zeer efficiënte manier voor de snelle bereiding van een breed scala van N-gekoppelde oligosacchariden (geraamd op meer dan 20.000 structuren) die gewoonlijk worden aangetroffen op menselijke glycoproteïnen. Om de gewenste structurele diversiteit, begon de strategie met de chemo-enzymatische synthese van drie soorten oligosaccharyl fluoride modules, gevolgd door hun stapsgewijze α-selectieve glycosylations op de 3-O en 6-O posities van de Mannose residu van de gemeenschappelijke kern trisaccharide hebben een cruciale β-mannoside-koppeling. Wij hechten verder de N– glycanen aan het oppervlak van een aluminium oxide beklede (ACG) glasplaatje om een covalente gemengde array voor de analyse van hetero-ligand interactie met een HIV-antistoffen te maken. In het bijzonder type het bindingsgedrag van een nieuw geïsoleerd HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen (bNAb), PG9, aan het mengsel van nauw verdeelde Man5GlcNAc2 (Man5) en 2,6-di-sialylated bi-antennary complex N– glycan (SCT ) op een array van ACG, opent een nieuwe laan te begeleiden van het ontwerp van de effectieve immunogeen voor HIV vaccinontwikkeling. Bovendien, belichaamt onze ACG matrix een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van andere HIV antilichamen voor hetero-ligand bindingsgedrag.
Introduction
N– glycanen op glycoproteïnen zijn covalent gekoppeld aan de asparagine (Asn) residu van de consensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, die gevolgen hebben voor verschillende biologische processen zoals eiwit bevleesdheid, antigenicity, oplosbaarheid en lectine herkenning 1 , 2. de chemische synthese van N-gekoppelde oligosacchariden vertegenwoordigt een significante synthetische uitdaging vanwege hun enorme structurele micro heterogeniteit en de zeer vertakte architectuur. Zorgvuldige selectie van de bescherming van groepen om af te stemmen reactiviteit van bouwstenen, bereiken van selectiviteit bij anomere centra, en het juiste gebruik van promotor / activator(s) zijn sleutelelementen voor de synthese van complexe oligosacchariden. Voor oplossen zulks werkstuk van complexiteit, een grote hoeveelheid werk te bevorderen van N– glycan synthese werd gemeld onlangs3,4. Ondanks deze robuuste benaderingen, het vinden van een effectieve methode voor de bereiding van een breed scala van N– glycanen (~ 20.000) blijft een grote uitdaging.
Een snelle mutatie koers van HIV-1 om de uitgebreide genetische diversiteit en haar vermogen om te ontsnappen aan de neutraliserende antilichaamrespons, is een van de grootste uitdagingen voor de ontwikkeling van een veilig en profylactische vaccin tegen HIV-15,6 , 7. een effectieve tactiek die HIV wordt gebruikt om te voorkomen dat de immuunrespons van de gastheer is de posttranslationele glycosylatie van envelop glycoproteïne gp120 met een divers N-gekoppeld glycanen afgeleid van de host glycosylatie machines8, 9. Een recent rapport betreffende de nauwkeurige analyse van recombinante monomeer HIV-1 gp120 glycosylatie van menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen suggereert het ontstaan van structurele microheterogeneity met een karakteristiek patroon van de cel-specifieke10 , 11 , 12. Daarom begrip glycan kenmerken van HIV-1 bNAbs vereist goed gekarakteriseerd gp120 gerelateerde N– glycan structuren in een hoeveelheid die voldoende is voor analyse.
De ontdekking van glycan microarray technologie verstrekt hoge doorvoer gebaseerde verkenning van de specifieke kenmerken van een breed scala van koolhydraten-bindende proteïnen adhesines van virussen/bacteriën, toxinen, antilichamen en lectines13,14 . De systematische glycanen regeling in een gekleed chip gebaseerde indeling kan bepalen problematisch lage affiniteit eiwit-glycan interacties via multivalent presentatie15,16,17,18. Deze glycan chip gebaseerde regeling lijkt gunstig effectief nabootsen cel interfaces. Verrijken van de technologie en de ongelijke probleem gekoppeld aan conventionele matrix formaten, ontwikkelde onze fractie recent een glycan array op een aluminium oxide-gecoat glas (ACG)-dia met behulp van phosphonic zuur-ended glycanen ter verbetering van de signaalsterkte, homogeniteit en gevoeligheid19,20.
Ter verbetering van de huidige kennis over glycan epitopen voor nieuw geïsoleerd HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen (bNAbs), hebben we een zeer efficiënte modulaire strategie voor de voorbereiding van een breed scala van N-gekoppelde glycanen21 ,22 worden afgedrukt op een ACG schuif (Zie Figuur 1). Specificiteit profiling studies van HIV-1 bNAbs op een matrix van ACG aangeboden de ongebruikelijke detectie van hetero-glycan bindingsgedrag van zeer potente bNAb PG9 dat werd geïsoleerd uit HIV geïnfecteerde individuen23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een klasse van HIV-1 bNAbs met inbegrip van PG9, PG16 en PGTs 128, 141-145 zeer krachtig in het neutraliseren van 70-80% van het circulerende HIV-1 isolaten werden gemeld. De epitopes van deze bNAbs zijn zeer bewaard onder de varianten van de hele HIV-1 groep M, dus zij kunnen begeleiden de effectieve immunogeen ontwerp voor een HIV-vaccin te ontlokken van neutraliserende antilichamen23,24,25 . Als een onderdeel van onze voortdu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de Thin Film Technology divisie, Instrument technologie Research Center (ITRC) en nationale toegepast Research Laboratories, wetenschapspark Hsinchu, Taiwan. Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor Wetenschappen (verlenen neen. MEESTE 105-0210-01-13-01) en de Academia Sinica.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
- Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
- Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
- Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
- Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
- Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
- Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
- Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
- Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
- Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
- Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
- Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
- Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
- Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
- Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
- Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
- Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
- Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
- McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
- Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
- Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
- de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).
