JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Published: February 05, 2018
doi:
10.3791/55855
, , ,
1Genomics Research Center,Academia Sinica

Summary

N– glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

Abstract

Ngeniş bir hızlı hazırlanması için son derece verimli bir şekilde tanıtacağız-bağlı yaygın insan glikoproteinlerin üzerinde bulunan (20.000 yapıları aşmayı tahmini) oligosakkaritler. İstenilen yapısal çeşitlilik ulaşmak için strateji oligosaccharyl florür modülleri, onların kademeli α-seçici glycosylations 3-Ey ve 6-Ey ardından üç tür kemoterapi enzimatik sentezi ile başladı. olarak konumlandırır bir çok önemli β-mannoside bağlantı sahip ortak çekirdek trisaccharide mannoz kalıntısı. Biz daha fazla kovalent karışık dizi analizi ile bir HIV antikor hetero-ligand etkileşim için oluşturmak için bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt yüzeyine N– glukanlardir bağlı. Özellikle, N– glycan (SCT bağlama davranışı bir yeni izole HIV-1 geniş nötralize antikor (bNAb), PG9, yakından aralıklı adam5GlcNAc2 karışımı (adam5) ve 2,6-di-sialylated BI antennary kompleks yazın ) ACG dizi etkili immunogen tasarım HIV aşı geliştirme için rehberlik için yeni bir cadde açar. Buna ek olarak, bizim ACG dizi diğer HIV antikor hetero-ligand bağlayıcı davranış için eğitim için güçlü bir araç içerir.

Introduction

N– glukanlardir glikoproteinlerin üzerinde kovalent asparagine için fikir birliği Asn-Xxx-Ser/Thr sequon kalıntısı (Asn) protein uyum, antigenicity, çözünürlük ve lektin tanıma gibi birçok biyolojik süreçlerin etkileyen bağlıdır 1 , 2. kimyasal sentez n-bağlantılı oligosakkaritler temsil eden önemli bir sentetik sorun onların büyük yapısal mikro heterojenite ve çok dallı mimarisi nedeniyle. Reaktivite yapı taşları, anomerik merkezleri ve organizatörü doğru kullanımı seçicilik ulaşmak ayarlamak için koruma dikkatli seçimi gruplar / activator(s) karmaşık oligosakkaritler sentezi temel unsurlarıdır. Karmaşıklık bu sorunu çözmek için N– glycan sentezi ilerlemek için iş büyük bir miktar bildirildi son zamanlarda3,4. Sağlam bu yaklaşımlardan rağmen büyük bir meydan (~ 20.000) kalıntıları N– glukanlardir geniş bir hazırlanması için etkili bir yöntem bulmak.

Geniş genetik çeşitlilik ve antikor yanıtı, nötralize kaçmak için onun yetenek elde etmek için HIV-1 hızlı mutasyon oranı olduğunu HIV-15,6 karşı güvenli ve profilaktik aşı geliştirmek için en büyük sorunları arasında , 7. konak immün yanıt önlemek için HIV kullanır bir etkili bir taktik olduğunu zarf glikoprotein gp120 farklı Nile post-translational glikozilasyon-bağlı ana bilgisayar glikozilasyon makine8, elde edilen glukanlardir 9. Rekombinant monomeric HIV-1 gp120 glikozilasyon insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerden kesin analizi ile ilgili son bir rapor karakteristik hücre özel desen10 ile yapısal microheterogeneity oluşumunu göstermektedir , 11 , 12. bu nedenle, N– glycan yapıları analiz için yeterli bir miktar HIV-1 bNAbs glycan özelliklerine gerektirir iyi karakterize gp120 anlayış ile ilgili.

Glycan Mikroarray teknoloji keşfi karbonhidrat bağlanıcı proteinler, virüs/bakteriyel adhesins, toksinler, antikorlar ve lectines13,14 çeşitli bir yelpazede özelliklerine yüksek üretilen iş tabanlı keşif sağlanan . Sistematik glukanlardir düzenleme dizilmiş çip tabanlı biçimde sorunlu düşük benzeşme protein-glycan etkileşimleri ile multivalent tanıtımı15,16,17,18belirleyebilir. Bu çip tabanlı glycan düzenleme uygun etkili hücre-hücre arabirimleri taklit etmek için görünür. Teknoloji zenginleştirmek ve geleneksel dizi biçimleri ile ilişkili düzensiz sorunu aşmak için bizim grup son zamanlarda bir glycan dizi phosphonic asit sona erdi glukanlardir sinyal yoğunluğu artırmak için kullanarak bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt üzerinde geliştirilen, homojenliği ve duyarlılık19,20.

Glycan epitopları yeni izole HIV-1 geniş antikorları (bNAbs) nötralize hakkında şimdiki anlayış geliştirmek için biz Ngeniş bir dizi hazırlanması için son derece verimli bir modüler strateji geliştirdik-bağlı glukanlardir21 ,bir ACG yazdırılacak22 (bkz. şekil 1) kaydırın. Özgüllük hetero-glycan bağlama davranışı son derece güçlü bNAb HIV izole PG9 sıradışı tespiti bireyler23,24,25enfekte HIV-1 bNAbs bir ACG dizisinde profil oluşturma çalışmaları sundu.

Protocol

1. D1/D2 hazırlanması kol modülleri22 Orta 2 hazırlanması Malzeme 1 ( Şekil 2′ de p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0,204 mmol) 15 mL tüp içine gösterilen) başlayarak tartmak ve arabellek (25 mM, pH 7.5) Tris içeren çözülür manganez ve (MnCl2, 10 mM) 5 mM bir son glycan konsantrasyon elde etmek için. 2 karş…

Representative Results

N -glukanlardir geniş bir dizi sentezi için modüler bir kemoterapi enzimatik strateji şekil 1′ de sunulmuştur. Çeşitlilik-ebilmek var olmak mahluk başında 3-Ey ve/veya 6-Ey α-özel mannosylation ardından üç önemli modüller kemoterapi enzimatik sentezi tarafından gerçeğine dayanarak stratejidir ortak mannoz kalıntısı konumunu N- glukanlardir trisaccharide çekirdek. İki, üç ve tetra antennary karmaþ?…

Discussion

HIV-1 bNAbs PG9, PG16 ve PGTs 128, 141-145 dahil olmak üzere bir sınıf olduğunu bildirdi HIV-1 yalıtır dolaşan % 70-80 nötralize son derece güçlü olmak. Bu bNAbs epitopları tüm HIV-1 Grup M türevleri arasında son derece korunmuş, bu nedenle nötralize antikorlar23,24,25 temin bir HIV aşısı için etkili immunogen Tasarım Kılavuzu . HIV-1 geniş antikorları nötralize glycan epitopları tanımlamak için bizi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ince Film teknolojisi bölümü, enstrüman Teknoloji Araştırma Merkezi (ITRC) ve ulusal uygulamalı araştırma laboratuvarları, Hsinchu bilim Parkı, Tayvan teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Konseyi tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. ÇOĞU 105-0210-01-13-01) ve Academia Sinica.

Materials

Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).

Tags

Chemo-enzymatic SynthesisN-glycansGlycan MicroarrayHIV Antibody ProfilingGlycobiologyCell Virus Specific GlycansGlycoarrayInfluenza DiagnosisCancer DiagnosisSerum AntibodiesGlycan SpecificitiesPhosphonic Acid LinkerPolyacrylamide GelTLCCerium Ammonium MolybdatePalladium HydroxideHydrogen Atmosphere
check_url/kr/55855?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C., Wong, C. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image