用于阵列发育和 HIV 抗体分析的糖的化学酶法合成
Summary
一个模块化的方法合成的N-糖的连接到铝氧化物涂层玻片 (动漫幻灯片) 已发展为糖微阵列, 它的使用, 以分析 HIV 广泛中和抗体已被证明。
Abstract
我们提出了一个高效的方法, 快速制备广泛的N连接的寡糖 (估计超过2万结构), 这是常见的人类糖蛋白。为了达到理想的结构多样性, 该策略开始于化学-酶合成三种 oligosaccharyl 氟化物模块, 其次是他们逐步α选择性 glycosylations 在 3-o和 6-o位置共核三的甘露糖残渣, 具有关键的β-mannoside 联系。我们进一步附上了N-糖到表面的氧化铝涂层玻璃 (动漫) 的幻灯片, 以创建一个共价键混合阵列分析异质配体与 HIV 抗体的相互作用。特别是, 新分离的 HIV-1 广义中和抗体 (bNAb), PG9 的结合行为, 对紧密间隔的人的混合物5GlcNAc2 (人5) 和 26 di sialylated 双 antennary 复合类型N-糖 (SCT) 在一个动漫阵列上, 开辟了一个新的途径, 以指导有效的免疫设计的 HIV 疫苗的开发。此外, 我们的动漫阵列体现了一个强大的工具, 研究其他 HIV 抗体的异配体结合行为。
Introduction
N-糖上的糖蛋白是共价链接到胺 (asn) 的残留的共识 asn-Xxx Ser/sequon, 这影响了几个生物过程, 如蛋白质构象, 抗原性, 溶解度, 和凝集素识别1,2. 由于其巨大的结构微异质性和高度分支的结构, 化学合成的N连接寡糖是一个重大的综合挑战。仔细选择保护组以调整积木的反应性, 在 anomeric 中心实现选择性, 以及适当使用启动子/活化剂是合成复合寡糖的关键因素。为了解决这个复杂的问题, 最近报告了大量的工作来推进N-糖合成, 目前已报道了3,4。尽管有这些健壮的方法, 但找到一种有效的方法来编写广泛的N-糖 (约 2万) 仍然是一个主要的挑战。
HIV-1 的快速突变率, 以实现广泛的遗传多样性和摆脱中和抗体反应的能力, 是最大的挑战, 以开发安全和预防性的疫苗对 HIV-15,6,7. HIV 病毒用于避免宿主免疫应答的一种有效策略是在转录糖蛋白 gp120 的后转化糖基化, 并有不同的N链接的糖从宿主糖化机械中获得8, 9。最近的一份报告关于重组单体 HIV-1 gp120 糖基化从人胚肾 (HEK) 293T 细胞, 建议发生结构不与一个典型的特定单元格模式10,11,12. 因此, 了解 HIV-1 bNAbs 的糖特性需要具有良好特征的 gp120 相关的N-糖结构, 其数量足以进行分析。
糖微阵列技术的发现提供了高吞吐量为基础的各种碳水化合物结合蛋白、病毒/细菌 adhesins、毒素、抗体和 lectines 的特异性的探索13,14.以阵列式芯片为基础的系统糖排列可以通过多表示15、16、17、18来确定有问题的低亲和力蛋白-糖相互作用。这种基于芯片的糖排列很方便地模拟了细胞的界面。为了丰富技术和克服与常规阵列格式相关的不均匀问题, 我们的小组最近开发了一个糖阵列在铝氧化物涂层玻璃 (动漫) 幻灯片上使用膦酸结束糖, 以提高信号强度,同质性和灵敏度19,20。
为了提高对新近分离的 HIV-1 中和抗体 (bNAbs) 的糖表位的了解, 我们开发了一种高效的模块化策略, 用于编写N链接的广泛的糖21 ,22将在一张动漫幻灯片上打印 (请参见图 1)。HIV-1 bNAbs 在一个动漫阵列上的特异性分析研究提供了异常检测的异糖结合行为的高强力 bNAb PG9 是孤立的 HIV 感染者的个人23,24,25。
Protocol
1. D1/D2 臂模块的制备22 中间体2的制备 重启动材料1 (如图 2所示, p-甲氧基苯基-邻-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranoside (100 毫克, 0.204 摩尔)) 成15毫升管, 溶解在三缓冲器中 (25 毫米, pH 7.5) 含有二氯化锰 (MnCl2, 10 毫米) 达到最终糖浓度5毫米。 添加2苷二磷酸半乳糖 (UDP-Gal)。…
Representative Results
在图 1中介绍了一种用于合成N糖的广泛数组的模块化化学酶策略。该战略是基于这样一个事实, 即在开始时可以通过化学-酶合成三重要的模块, 然后在 3-o和/或 6-o位置的α特异性 mannosylation 共同N-糖的核心三。考虑到双、三、四 antennary 复杂类型的N-糖结构的结构多样性, 我们认为, 一组 oligosaccharyl 的捐赠者和预安装的?…
Discussion
据报道, 一类 HIV-1 bNAbs, 包括 PG9、PG16 和 PGTs 128, 141-145 在中和 70-80% 循环 HIV-1 分离株中具有极强的效力。这些 bNAbs 的表位是高度保守的变种的整个 HIV-1 组 M, 因此他们可以指导有效的免疫设计的 HIV 疫苗, 以引出中和抗体23,24,25.作为我们正在进行的努力的一部分, 以确定糖表位的 HIV-1 广泛中和抗体, 我们报告了化学和酶合成的高?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢台湾新竹科学园的薄膜技术部、仪器技术研究中心 (增加) 和国家应用研究实验室。这项工作得到了国家科学理事会的支持 (核准号为。最多 105-0210-01-13-01) 和中央研究院。
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
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Cite This Article
Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C., Wong, C. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).