Kemo-enzymatisk syntese af N- glycans for arrayet udvikling og HIV antistof profilering
Summary
En modulopbygning til syntese af N– glycans for vedhæftet fil i en aluminium oxid-belagt glas glide (ACG dias) som en glycan microarray er blevet udviklet og dets anvendelse til profilering af en HIV bredt neutraliserende antistoffer er blevet påvist.
Abstract
Vi præsenterer en meget effektiv måde til hurtig fremstilling af en bred vifte af N-forbundet oligosaccharider (skønnes for at overstige 20.000 strukturer), der er almindeligt forekommende på menneskelige glykoproteiner. For at opnå den ønskede strukturelle mangfoldighed, strategien begyndte med kemo-enzymatisk syntese af tre slags oligosaccharyl fluor moduler, efterfulgt af deres trinvis α-selektive glycosylations på den 3-O og 6-O holdninger af den mannose rester af den fælles core trisaccharide at have en afgørende β-mannoside kobling. Vi yderligere knyttet N– glycans til overfladen af en aluminium oxid-belagt glas (ACG) dias til at oprette en kovalent blandet array til analyse af hetero-ligand interaktion med en HIV-antistof. Især type bindende opførsel af en nyligt isolerede HIV-1 bredt neutraliserende antistof (bNAb), PG9, at blandingen af tætliggende mand5GlcNAc2 (mand5) og 2,6-di-sialylated bi-antennary kompleks N– glycan (SCT ) på arrayet ACG åbner en ny avenue for at guide de effektive immunogenerne design for HIV vaccine udvikling. Derudover indeholder vores ACG array et kraftfuldt værktøj til at studere andre HIV antistoffer for hetero-ligand bindende adfærd.
Introduction
N– glycans på glykoproteiner hænger kovalent sammen med asparagin (Asn) rester af konsensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, der påvirker flere biologiske processer såsom protein kropsbygning, antigenicity, opløselighed og lektin anerkendelse 1 , 2. den kemiske syntese af N-sammenkædede oligosaccharider repræsenterer en betydelig syntetiske udfordring på grund af deres enorme strukturelle mikro heterogenitet og stærkt forgrenede arkitektur. Omhyggelig udvælgelse af beskytte grupper for at tune reaktivitet af byggeklodser, at opnå selektivitet på anomere Centre og korrekt brug af promotor / activator(s) er centrale elementer i syntese af komplekse oligosaccharider. For at løse dette problem med kompleksiteten, en stor mængde af arbejde for at fremme N– glycan syntese blev rapporteret seneste3,4. Trods disse robuste tilgange, finde en effektiv metode til fremstilling af en bred vifte af N– glycans (~ 20.000) er fortsat en stor udfordring.
Hurtig mutation er i HIV-1 for at opnå den omfattende genetiske mangfoldighed og dens evne til at flygte fra neutraliserende antistof reaktion, blandt de største udfordringer at udvikle en sikker og forebyggende vaccine mod HIV-15,6 , 7. en effektiv taktik, som HIV bruger til at undgå immunrespons vært er den posttranslationelle glykosylering af kuvert glycoprotein gp120 med et mangfoldigt N-knyttet glycans stammer fra værten glykosylering maskiner8, 9. En nylig rapport om den præcise analyse af rekombinant monomere HIV-1 gp120 glykosylering fra menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler tyder på forekomsten af strukturelle microheterogeneity med en karakteristisk celle-specifikke mønster10 , 11 , 12. derfor forståelse glycan særegenheder af HIV-1 bNAbs kræver godt karakteriseret gp120 relateret N– glycan strukturer i en mængde tilstrækkelig til analyse.
Opdagelsen af glycan microarray teknologi forudsat høj overførselshastighed-baserede udforskning af særlige forhold i en bred vifte af kulhydrat-bindende proteiner, virus/bakteriel adhesins, toksiner, antistoffer og lectines13,14 . Den systematiske glycans arrangement i en klædt chip-baserede format kunne bestemme problematisk lav affinitet protein-glycan interaktioner gennem multivalent præsentation15,16,17,18. Denne chip-baserede glycan arrangement synes bekvemt at effektivt efterligner celle-celle grænseflader. For at berige teknologien og overvinde den ujævne problem forbundet med konventionelle array formater, udviklet vores gruppe for nylig en glycan array på en aluminium oxid-belagt glas (ACG) dias ved hjælp af phosphonic syre-ended glycans for at forbedre signal intensitet, homogenitet og følsomhed19,20.
For at forbedre den aktuelle viden om glycan epitoper af nyligt isolerede HIV-1 bredt neutraliserende antistoffer (bNAbs), har vi udviklet en yderst effektiv modulære strategi for udarbejdelsen af en bred vifte af N-knyttet glycans21 ,22 skal udskrives på en ACG slide (Se figur 1). Specificitet profilering studier af HIV-1 bNAbs på arrayet ACG tilbudt den usædvanlige påvisning af hetero-glycan bindende opførsel af højpotente bNAb PG9, der blev isoleret fra HIV smittede individer23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
En klasse af HIV-1 bNAbs herunder PG9, PG16 og PGTs 128, 141-145 blev rapporteret at være yderst potent i neutralisere 70-80% af det cirkulerende HIV-1 isolater. Epitoper af disse bNAbs er meget bevaret blandt varianterne af den hele HIV-1 gruppe M, således de kan guide den effektive immunogenerne design for en HIV-vaccine, der kan fremkalde neutraliserende antistoffer23,24,25 . Som en del af vores igangværende bestræbelser …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke tynde Film teknologi Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) og nationale anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Dette arbejde blev støttet af National Science Council (give nr. De fleste 105-0210-01-13-01) og Academia Sinica.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
- Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
- Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
- Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
- Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
- Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
- Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
- Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
- Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
- Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
- Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
- Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
- Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
- Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
- Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
- Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
- Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
- Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
- McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
- Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
- Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
- de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).
