Synthèse de chimio-enzymatique des N- glycans pour le développement de la baie et anticorps anti-VIH de profilage
Summary
Une approche modulaire de la synthèse des N– glycans à fixer sur un verre recouvert d’oxyde d’aluminium glisser (slide NOC) comme un microréseau glycane a été mis au point et son utilisation pour la détermination des caractéristiques d’un VIH largement anticorps neutralisant a été démontrée.
Abstract
Nous présentons un moyen très efficace pour la préparation rapide d’un large éventail de N-liée d’oligosaccharides (évalués à plus de 20 000 structures) que l’on retrouve communément sur les glycoprotéines humaines. Pour atteindre la diversité structurale désirée, la stratégie a commencé avec la synthèse enzymatique chimio des trois types de modules de fluorure d’oligosaccharyl, suivies de leurs glycosylations α sélectifs par étapes à la 3-O et 6-O les positions de la résidus mannose du trisaccharide noyau commun ayant une liaison β-mannoside crucial. Nous attachée plus loin le N– glycans à la surface d’une lame de verre enduit d’oxyde d’aluminium (NOC) pour créer un tableau mixte covalent pour l’analyse de l’interaction ligand-hétéro avec un anticorps anti-VIH. En particulier, le comportement de liaison d’un nouvellement isolé du VIH-1 largement anticorps neutralisant (bNAb), PG9, au mélange de rapprochées Man5GlcNAc2 (Man5) et le 2, 6-di-sialylés bi-antennaire complexe type N– glycanes (SCT ) sur un tableau de NOC, ouvre une nouvelle voie pour guider la conception immunogène efficace pour le développement de vaccin contre le VIH. En outre, notre gamme de NOC incarne un outil puissant pour étudier les autres anticorps anti-VIH pour le comportement de liaison du ligand-hétéro.
Introduction
N– glycans sur les glycoprotéines sont liées de façon covalente à l’asparagine (Asn) résidus du consensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, qui affectent plusieurs processus biologiques telles que la reconnaissance de conformation, antigénicité, solubilité et la lectine protéine 1 , 2. la synthèse chimique des N-oligosaccharides liés représente un défi synthétique important en raison de leur énorme hétérogénéité structurale de micro et de l’architecture très ramifiée. Une sélection rigoureuse de la protection des groupes pour optimiser la réactivité des blocs de construction, réalisation de sélectivité à l’anomère centres et l’usage approprié du promoteur / activateur est des éléments clés dans la synthèse d’oligosaccharides complexes. Pour résoudre ce problème de complexité, une grande quantité de travail pour faire progresser les N– glycanes synthèse a été signalée récemment3,4. En dépit de ces approches robustes, trouver une méthode efficace pour la préparation d’une vaste gamme de N– glycanes (~ 20 000) reste un grand défi.
Le taux de mutation rapide du VIH-1 pour atteindre la vaste diversité génétique et sa capacité à échapper à la neutralisation des anticorps, est parmi les plus grands défis pour développer un vaccin sûr et prophylactique contre le VIH-15,6 , 7. une tactique efficace que le VIH utilise pour éviter la réaction immunitaire l’hôte est la glycosylation post-traductionnelle d’enveloppe glycoprotéine gp120 avec une diverse N-liée glycanes dérivée de l’hôte glycosylation machines8, 9. Un rapport récent concernant l’analyse précise de glycosylation monomère recombinante de gp120 du VIH-1 de cellules 293 t rein embryonnaire humain (HEK) suggère la présence de microheterogeneity structurel avec une caractéristique spécifique des cellules modèle10 , 11 , 12. par conséquent, la compréhension des spécificités de glycane de VIH-1 bNAbs nécessite bien caractérisé gp120 liés N– glycane structures en quantité suffisante pour l’analyse.
La découverte de la technologie des microréseaux glycane fourni haut débit d’exploration des spécificités d’une gamme variée de protéines de liaison aux glucides, adhésines de virus/bactéries, toxines, anticorps et lectines13,14 . L’arrangement systématique de glycanes dans un format de puce qui pourrait déterminer les interactions de protéine-glycane problématique de faible affinité par présentation multivalents15,16,17,18. Cet arrangement de glycane puce semble idéalement imiter efficacement les interfaces de cellules. Pour enrichir la technologie et de surmonter le problème inégal associé à des formats de tableau conventionnel, notre groupe a récemment mis au point un tableau de glycane sur une lame de verre revêtu d’oxyde d’aluminium (NOC) à l’aide de glycanes de culot acide phosphonique pour accroître l’intensité du signal, homogénéité et sensibilité19,20.
Afin d’améliorer la compréhension actuelle de glycane épitopes du VIH-1 nouvellement isolé largement neutraliser les anticorps (bNAbs), nous avons développé une stratégie modulaire très efficace pour la préparation d’un large éventail de N-liée glycanes21 ,22 à imprimer sur un NOC glisser (voir Figure 1). Spécificité de profilage études du VIH-1 bNAbs sur un tableau de NOC offert la détection inhabituelle du comportement de liaison de hétéro-glycane de très puissant bNAb PG9 qui a été isolé chez le VIH infectées personnes23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une classe de VIH-1 bNAbs y compris PG9 et PG16 PGTs 128, 141-145 ont été signalés à être très puissant dans la neutralisation des 70-80 % des isolats de VIH-1 en circulation. Les épitopes de ces bNAbs sont très conservés parmi les variantes de l’ensemble du VIH-1 groupe M, donc ils peuvent guider la conception de l’immunogène efficace pour un vaccin contre le VIH susciter la neutralisation des anticorps23,24,25 . …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient la Division de technologie Thin Film Instrument Technology Research Center (ITRC) et laboratoires de recherche nationaux appliqués, parc scientifique de Hsinchu, Taiwan. Ce travail a été soutenu par le Conseil National de la Science (n° de subventions. La plupart 105-0210-01-13-01) et l’Académie chinoise des sciences.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
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